[发明专利]一种生产乙醇的基因工程蓝细菌

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产乙醇的基因工程蓝细菌。本发明构建了由pcpc560强启动子驱动的pdc和yqhd整合入蓝细菌基因组slr0301位点的载体pMD0301‑pdc/yqhd。进一步利用分子生物技术，引入外源基因maeB同时敲除蓝藻糖原靶向功能基因（slr1176）以敲除糖原竞争性途径，构建由pcpc560启动子驱动的苹果酸盐基因（maeB）整合入蓝细菌基因组slr1176位点的载体pJS503‑maeB。证实通过光强启动子Pcpc560替代铜离子诱导启动子PpetE，增强外源基因的表达提高pdc和yqhd酶的表达来提高蓝细菌中乙醇产量，同时提高中间体丙酮酸产量可进一步提升乙醇的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产乙醇的基因工程蓝细菌。

背景技术

随着煤炭和石油等化石燃料的消耗引起一系列问题。一方面，化石燃料的燃烧造成了严重的环境问题，如酸雨、温室效应等。另一方面，化石燃料作为一种不可再生资源，面临着能源枯竭的问题。因此，可再生生物燃料的开发引起了世界各的关注。生物乙醇作为一种可再生生物燃料，引起了世界各地研究人员的兴趣。

在生物技术领域，人们越来越有兴趣利用蓝藻作为光合微生物细胞工厂生产各种高价值的分子产品，如乙烯、丙酮、异戊二烯和异丁醇。为了获得目标生物燃料的有效生产，蓝藻已经通过构建多种类型的异源生物合成途径进行了基因修饰。然而，基于蓝藻的合成平台在工业生产应用中有待进一步研究，其中生产产量仍不理想。这是因为在构建用于生产目标化合物的工程代谢途径中，需要以一些内源性基础代谢物的有效利用作为基础如丙酮酸和乙酰辅酶A。然而这些内源性基础代谢物往往被消耗在细胞生长和生理活动的内源性途径中，包括氨基酸合成和TCA循环，这限制了生物合成途径合成化学品的生产产量。为了最大限度地利用合成的化学物质的产量，一种方法是在强启动子的驱动下，通过过度表达密码子优化的光合蓝藻外源基因，对生物合成途径进行基因修饰。另一种替代方法是减少内源性代谢对碳资源的潜在竞争，并使更多的碳和能量通量用于蓝藻的化学生产。

发明内容

有鉴于此，为了增加蓝藻生产乙醇的产量，本发明提供了一种生产乙醇的基因工程蓝细菌。本发明首次验证在蓝藻中引入外源基因maeB以及敲除slr1176基因对提高蓝藻生产乙醇的正面作用，可高效提高乙醇的生物合成。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

在本发明的一个方面，在集胞藻PCC6803中构建一条高效合成生物乙醇的代谢途径，利用同源替换敲除蓝藻中的slr1176基因以实现乙醇在集胞藻PCC6803体内的合成。

本发明提供了一种生产乙醇的基因工程蓝细菌，所述蓝藻为集胞藻PCC6803，所述蓝细菌中含有活性的启动子可操作的连接第一基因和第二基因；其中，第一基因为丙酮酸脱羧酶基因，其序列如SEQ ID NO.3 所示，第二基因为NADPH依赖型醛还原酶基因，其序列如SEQ ID NO.4所示；所述的具有活性的启动子是光强启动子Pcpc560，其序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步地，所述蓝细菌引入NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB基因，敲除slr1176基因；所述maeB基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

所述蓝细菌通过基因手段使光强启动子Pcpc560驱动丙酮酸脱羧酶及NADPH依赖型醛还原酶的一个和/或多个基因位点表达。

本发明的另一方面是通过选取大肠杆菌的NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB作为外源基因，该基因表达产物将三羧酸循环中间代谢物苹果酸盐转化为丙酮酸，同时产生NADPH，而后丙酮酸脱羧酶与NADPH依赖型醛还原酶共表达将丙酮酸转化为生物乙醇，并消耗NADPH，可有效提高NADPH依赖型醛还原酶活性并提高乙醇产量。