[发明专利]基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法

说明书

本发明涉及基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，借助现有的HPLC技术对核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性进行快速检测，采用环核苷酸为反应底物，环核苷酸在环核苷酸磷酸二酯酶的催化后分解为GMP，而GMP会进一步代谢为核苷和碱基，环核苷酸可以通过紫外吸收光(254nm)检测。检测时可以通过反应底物环核苷酸产生的峰面积来判断其残余量，进而计算出核苷酸磷酸二酯酶抑制剂的活性，相较于现有的检测方式，本发明中的检测方法简便、快捷、成本低。

技术领域

本发明涉及生物分析化学技术领域，具体涉及一种HPLC检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法。

背景技术

高效液相色谱(HPLC)的工作原理是混合物各组分通过与固定相、流动相之间的相互作用，在色谱柱中进行分离纯化。

固定相是存在于色谱柱中一种非常小的多孔颗粒材料，流动相是在高压迫使下通过色谱柱的一种溶剂或混合溶剂。用注射器注入样品，通过一个连接样品回路的阀门，使样品与流动相混合，随后样品中各组分以不同的速率通过色谱柱，由于各组分与固定相之间的吸附能力不同，各组分依次流出色谱柱，通过合适的检测器将组分浓度转换成电信号传递到计算机的HPLC软件上。运行结束后，在HPLC软件中就可以得到色谱图。

环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)是一种水解环鸟苷酸(cGMP)的酶，PDE5A1是其中的一种亚型。

环核苷酸(cGMP)是机体广泛存在的一种重要活性物质。环核苷酸是人体内重要的第二信使，参与机体多种信号通路。环核苷酸不仅可以调节能量的代谢，而且可以调控神经递质的传递、基因表达、激素调节、免疫反应以及细胞的增殖和分化等，对血管的舒张、神经递质的传递以及肾脏功能均有调控作用。

发明内容

本发明的目的在于，提出基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，解决决明子提取物区分困难的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：基于高效液相色谱法检测环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性的方法，包括以下步骤：

步骤一、将环核苷酸溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到环核苷酸溶液；

步骤二、将环核苷酸磷酸二酯酶溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到环核苷酸磷酸二酯酶溶液，预先于35℃水浴中温育3～10min，与不同浓度的环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂混合均匀，得到混合溶液；

步骤三、将步骤一中的环核苷酸溶液预先于35℃水浴中温育3～10min，然后将步骤二中的混合溶液加入到环核苷酸溶液中，形成反应体系；

步骤四、将步骤三中的反应体系于35℃水浴温育，然后于100℃水浴加热，得到最终溶液；

步骤五、将最终溶液进样到高效液相色谱仪中，检测环核苷酸浓度，借此推算出环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂活性。

优选的是，所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为40-60mM,pH＝8。

优选的是，所述环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂为西地那非。

优选的是，所述反应体系中包含浓度为0.01～0.5μg/mL的环核苷酸磷酸二酯酶溶液，浓度为0～750nM的西地那非溶液，终浓度为0.5～150μg/mL的环核苷酸溶液。

优选的是，所述步骤五中，高效液相色谱仪使用KromasilC18色谱柱，4.6mm×250mm，粒度5μm。

优选的是，所述步骤五中，使用的流动相为90％缓冲溶液，10％甲醇。

优选的是，所述缓冲溶液为6.8mg/mL的磷酸二氢钾水溶液。

优选的是，所述高效液相色谱分仪中的流动相流速为1ml/min。