[发明专利]检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用

说明书

本发明属于烟草黑胫病检测技术领域。针对烟草黑胫病菌检测难度大的问题，本发明提供一种基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用、检测烟草黑胫病菌的PCR引物对、试剂盒及方法。探针基因如SEQ ID NO:1所示；引物对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。提取发病烟草的基因组DNA，通过PCR克隆该特异基因，如果能克隆到目的片段，则说明是黑胫病菌侵染，如果不能克隆到目的片段，则说明不是黑胫病菌侵染。

技术领域

本发明属于烟草黑胫病检测技术领域，具体涉及一种检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用。

背景技术

烟草黑胫病是烟草上的重要根茎病害，给烟草生产造成巨大损失。在大田中烟草上的根部病害主要有黑胫病、青枯病、根黑腐病等。其中黑胫病属于卵菌病害，青枯病属于细菌病害，根黑腐病属于真菌病害。由于这几种病害的症状相似，难于辨别，给病害防治造成很大困难。传统的病害鉴定常以生物学鉴定为主，过程复杂，准确度差。本发明运用分子生物学技术对对田间黑胫病进行鉴定，提高了病害鉴定的准确性和效率。

发明内容

针对烟草黑胫病菌检测难度较大的上述问题，本发明提供一个基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用、检测烟草黑胫病菌的PCR引物对、试剂盒及方法。本发明的目的基因只在黑胫病菌基因组内存在，可以作为检测黑胫病的探针基因；根据目的基因序列设计引物，提取发病烟草的基因组DNA，通过PCR克隆该特异基因，如果能克隆到目的片段，则说明是黑胫病菌侵染，如果不能克隆到目的片段，则说明不是黑胫病菌侵染。

本发明是通过以下步骤实现的：

一个基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用，所述基因片段如SEQID NO:1所示。

本发明还提供一种检测烟草黑胫病菌的PCR引物对，其正向引物序列如SEQ IDNO:2所示；反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供一种检测烟草黑胫病菌的试剂盒，包括权利要求2所述的引物对。

进一步的，所述试剂盒还还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和ddH₂O。

本发明还提供一种检测烟草黑胫病菌的方法：从烟草植株上刮取发病组织，提取DNA，以所提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现540bpDNA条带，则待测样本为烟草黑胫病菌。

进一步的，上述方法的PCR扩增反应条件为：94℃变性1min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

本发明通过烟草黑胫病菌一个特异基因(SEQ ID NO:1)可以有效鉴别黑胫病菌，该基因只在黑胫病菌中表达，青枯病和根黑腐病菌基因组里都不包含该基因。

本发明的引物对的扩增特异性好，扩增产物干净杂带少，电泳检测时间短，条带清晰好判断。

附图说明

图1为探针基因在不同物种基因组DNA中的检测情况，1-烟草黑胫病菌；2-烟草青枯病菌；3-烟草根黑腐病菌；4-烟草品种K326；5-烟草品种革新3号；6-烟草花叶病毒(TMV，侵染烟草，引起花叶病毒病)；7-黄瓜花叶病毒(CMV，侵染烟草，引起花叶病毒病)；

图2为应用例PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例

(一)实验所用材料

烟草黑胫病菌，烟草青枯病菌，烟草根黑腐病菌，烟草品种K326，烟草品种革新3号，烟草TMV，烟草CMV