[发明专利]系列低产高级醇酿酒酵母及其构建方法与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是系列低产高级醇酿酒酵母及其构建方法与应用，通过在出发菌株中分别采用糖诱导型启动子P_hxt3、P_hxt4、P_hxt7、P_hxt2过表达乙醛脱氢酶ALD6基因，得到系列低产高级醇酿酒酵母。在传统黄酒发酵中，其总高级醇(主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇)生成量与出发菌株相比分别降低了42.56％、37.84％、30.74％和19.26％。该类型启动子受不同葡萄糖浓度的响应，可以调控ALD6基因在黄酒发酵过程中过表达从而达到降低高级醇的目的；同时抑制ALD6基因在种子培养阶段的表达从而避免其对酵母生长的影响。并且生长性能、发酵性能与出发菌株没有显著差异。本发明所述酿酒酵母可应用于降低传统黄酒发酵中高级醇含量，具有广阔的市场前景。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是系列低产高级醇酿酒酵母及其构建方法与应用。

背景技术：

高级醇是黄酒中的一种重要的风味物质，和黄酒的品质直接相关。适量的高级醇对酒体呈香呈味有积极作用，但高级醇含量过高，酒体就会产生异杂味且有较强的致醉性。随着人们物质水平的不断提高，消费者偏向于风味、健康双导向产品。但黄酒较其他酒而言高级醇含量较高，消费者普遍反映有易上头、易醉等现象，这一定程度制约了黄酒行业的发展。因此控制黄酒中高级醇含量成为我国黄酒行业亟需解决的问题。

在现有的黄酒生产中，主要是通过发酵原料、氮源含量、发酵温度、酵母接种量的传统方法对高级醇进行控制。这些传统的方法对生产工艺要求严格，不同批次间调控效果差异较大，效果并不理想。近年来，通过基因工程对酿酒酵母进行定向改造从而降低其高级醇生成量引起了广泛的关注。高级醇主要由酵母从两条途径产生。一是氨基酸分解代谢途径，即Ehrlich途径，二是合成代谢途径，即Harris途径。目前已经有很多报道通过这两条途径对高级醇进行调控。但是这些研究一方面主要集中于对单个高级醇进行调控，无法有效控制酿酒酵母的总高级醇含量(主要包括异丁醇、异戊醇、正丙醇和苯乙醇)。比如支链氨基酸转氨酶基因BAT2，该基因的敲除仅能降低酵母异丁醇和异戊醇生成量，对其他高级醇影响较小，效果并不理想。而另一方面部分研究对高级醇相关基因的改造虽然可以有效控制高级醇总量，但在此过程中对酵母生长发酵性能影响较大。比如乙醛脱氢酶基因ALD6，可以将部分高级醇的前体物质醛类氧化成为酸类物质。采用组成型强启动子调控该基因过表达可以显著降低酿酒酵母高级醇的生成量。但在酵母种子培养阶段，较高的糖浓度有利于组成型启动子调控ALD6基因过表达，影响了酵母的正常生长。在实际黄酒生产过程中，酵母种子培养质量非常重要，这一弊端就限制了该方法的实际应用。因此合理调控ALD6基因过表达是选育性状优良的低产高级醇酿酒酵母菌株的一个新思路，在有效控制高级醇的同时，不影响酵母的种子培养及生长、发酵性能。这一思路可以有效控制黄酒中各类高级醇含量，并在生产应用时可以摆脱种子培养性能差的问题，具有广阔的应用前景。

发明内容：

为解决上述技术问题，本发明提供系列启动子过表达乙醛脱氢酶基因ALD6的新应用，即利用不同糖诱导型启动子过表达乙醛脱氢酶基因降低酿酒酵母高级醇生成量的方法及其应用。具体是在酿酒酵母中分别通过启动子P_hxt3、P_hxt4、P_hxt7和P_hxt2过表达乙醛脱氢酶基因实现总高级醇(包括正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇)不同程度的降低。在传统的黄酒发酵中，与出发菌株相比，总高级醇分别降低了42.56％、37.84％、30.74％和19.26％；这四种启动子受到酵母种子培养时期初期高糖浓度(葡萄糖浓度120g/L)的抑制从而降低了该时期ALD6基因的表达量，避免了此阶段对酵母生长的影响。在黄酒发酵阶段，这四种启动子受到发酵前中期低糖和中糖浓度(葡萄糖浓度10～60g/L)的诱导，相对提高了ALD6基因的表达量，达到控制高级醇生成的目的，且发酵性能不受影响。

本发明将提供一种采用上述方法或在上述方法基础上构建的系列低产高级醇酿酒酵母菌株及其应用。