[发明专利]一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法

权利要求书

1.一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，试剂盒 包括玻璃纤维膜（ 1）、KIM-1检测线（2）、NGAL检测线（3）、mALB检测线（4）、质控线（5）、卡壳（6）和加样孔（7）；所述玻璃纤维膜（1）的上表面从左到右依次设置有KIM-1检测线（2）、NGAL检测线（3）、mALB检测线（4）和质控线（5）；所述玻璃纤维膜（1）的外部套接设置有卡壳（6）；所述卡壳（6）的左侧上表面开设加工有加样孔（7）；所述KIM-1检测线（2）和NGAL检测线（3）、所述NGAL检测线（3）和mALB检测线（4）之间的距离为4至6毫米；所述mALB检测线（4）和质控线（5）之间的距离为3至4毫米；在所述玻璃纤维膜（1）正上方的所述卡壳（6）上表面位置开设加工有观测口；其特征在于，制备具体包括如下步骤：

步骤S1：首先进行活化液的配制，称量10.66g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌均匀后，用NaOH溶液调整pH至6.0，定温到4℃，保存备用；

步骤S2：再进行偶联液的配制，称量1.066g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整pH至6.5，定温到4℃，保存备用；

步骤S3：然后进行微球保存液配制，称量0.718g硼酸、0.798g四硼酸钠、10g牛血清蛋白、5g月桂醇聚氧乙烯醚-23、1g吐温-20和50g的蔗糖于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整pH至8.0，定温到4℃，保存备用；

步骤S4：微球液配制，取1ml浓度为1umol/L，粒径为100nm，发射波长为614nm的量子点微球加入到所述步骤S1调配好的活化液中，活化液取5ml，搅拌混匀溶解；

步骤S5：微球活化，在所述步骤S4配制好的微球溶解液中加入4mg EDC和40mg NHS，然后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，活化30min，活化好后取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入所述步骤S2配制好的偶联液重悬，得到活化的荧光微球溶液；

步骤S6：KIM-1抗体偶联液配制，将2mg KIM-1标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到KIM-1抗体标记荧光微球；

步骤S7：NGAL抗体偶联液配制，将1.5mg NGAL标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到NGAL抗体标记荧光微球；

步骤S8：mALB抗体偶联液配制，将3mg的NGAL标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到mALB抗体标记荧光微球；

步骤S9：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个荧光微球溶液分别按体积比值2：4：3进行混合调配，并且搅拌均匀待用；

步骤S10：玻璃纤维膜制备，将玻璃纤维膜裁成20mm*30mm的尺寸，浸泡于20mM的PB处理液中，室温浸泡1h，然后放置在37℃的烘箱中，干燥12小时；

步骤S11：将步骤S10制备好的玻璃纤维膜放在喷金仪器上，然后将所述步骤S9混合调配的三种抗体量子点免疫荧光微球溶液喷到玻璃纤维膜上，再放入37℃烘箱干燥2小时后，即可制得成品玻璃纤维膜待后续步骤使用；

步骤S12：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个荧光微球溶液分别稀释至1mg/ml、2mg/ml和1.5mg/ml的浓度，再通过喷金仪器，用0.5ul/cm的喷量依次喷划在所述步骤S11制备的玻璃纤维膜已划好分割线的不同区域形成KIM-1检测线（2）、NGAL检测线（3）和mALB检测线（4）；将兔抗鸡稀释液稀释至1mg/ml，再通过喷金仪器以1.5ul/cm的划量划在所述步骤S11制备的玻璃纤维膜已划好分割线的区域形成质控线（5）；

步骤S13：将所述步骤S12处理后的玻璃纤维膜（1）装入卡壳（6）内即得量子点免疫荧光检测三联试剂盒。