[发明专利]一种高效生产类克隆鸡的方法

说明书

本发明涉及一种高效生产类克隆鸡的方法，包括以下步骤：（1）、构建OCT4,SOX2,NANOG,LIN28四因子的慢病毒过表达载体并转染黑羽狼山鸡成纤维细胞CEF；（2）、利用诱导培养基将转染OSNL的狼山鸡成纤维细胞CEF诱导为iPSCs，对诱导形成的iPSCs进行传代并进行鉴定；（3）、利用诱导培养基将诱导形成的iPSCs进行诱导分化为PGC‑like，并进行鉴定；（4）、收集PGC‑like细胞并将其通过鸡胚血管注射的方法注射至孵化2.5天的隐性白羽鸡胚血管中，并通过冰冻切片方法确定PGC‑like能够在受体隐性白羽鸡中的迁移归巢；（5）、将注射黑羽狼山鸡PGC‑like细胞的隐性白羽受体鸡胚继续孵化至至出壳。通过微卫星技术证明黑羽后代来源于供体的PGC‑like细胞。通过本发明，可大量生产与供体遗传特征相同的类克隆鸡。

技术领域

本发明涉及一种高效生产类克隆鸡的方法，属于生物技术领域。

背景技术

体细胞克隆技术在哺乳动物上被广泛地用来研究细胞特性，在研究基因结构和功能、基因治疗、遗传病的发生和治疗、濒危动物物种复原等方面具有巨大的应用价值。然而，这一技术在鸟类和两栖类等卵生动物上无法实施，这极大的限制了禽类科研和生产研究相关的发展。而禽类PGCs移植技术提供了一种生产类克隆鸡的替代方案。2006年，Larval等进行了鸡异体间PGCs移植并产生了后代，证明了这是目前在家禽中唯一可高效实现体细胞克隆的途径。但是，原代分离的PGCs数量较少，远不能满足实际移植时的需求，这就限制了该技术的应用。通过ESCs诱导PGCs作为解决PGCs来源的技术仍然存在获取困难、数量少的问题。而体细胞重编程可将易于获得的皮肤或组织细胞诱导为iPSCs，研究亦表明全能干细胞能够在体外被诱导形成PGCs，这能够有效的解决目前鸡PGCs难以大量获取的关键问题。但是目前在家禽上尚未有明确的技术方案，这极大的限制了克隆技术在家禽上的推广应用，需要进一步的优化和改进。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有问题，提供一种高效生产类克隆鸡的方法。

本发明的技术方案是：一种高效生产类克隆鸡的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）、构建OCT4, SOX2, NANOG, LIN28四因子的慢病毒过表达载体并转染黑羽狼山鸡成纤维细胞CEF；

（2）、利用第一诱导培养基将转染四因子的狼山鸡成纤维细胞CEF诱导为iPSCs，在诱导的第5天细胞形态发生显著变化，逐渐聚集变圆，贴壁能力下降，此时将细胞转移至丝裂霉素处理后的CEF饲养层上培养，整个诱导过程持续21天；对诱导形成的iPSCs进行传代并进行鉴定；第一诱导培养基配方为Knockout DMEM、10%FBS、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1%非必需氨基酸、1000IU/mLLIF、10ng/mLbFGF、5ng/mL SCF、1%的青链霉素、2%鸡血清；

（3）、利用第二诱导培养基将诱导形成的iPSCs进行诱导分化为PGC-like，并通过PAS糖原染色、间接免疫荧光进行鉴定；第二诱导培养基配方为基础因子培养基、40ng/mlBMP4、40ng/ml BMP8b 、50ng/ml EGF；

（4）、收集PGC-like细胞并将其通过鸡胚血管注射的方法注射至孵化2.5天的隐性白羽鸡胚血管中，并通过冰冻切片方法确定PGC-like能够在受体隐性白羽鸡中的迁移归巢；

（5）、将注射黑羽狼山鸡PGC-like细胞的隐性白羽受体鸡胚继续孵化至至出壳，即，F0代；饲养至性成熟并进行相互交配，收集种蛋并进行孵化，获得黑羽后代，并通过微卫星技术证明黑羽后代来源于供体的PGC-like细胞，至此完成类克隆鸡的生产。

步骤（2）中，对诱导形成的iPSCs进行传代并通过间接免疫荧光、碱性磷酸酶染色、染色体核型分析方法进行鉴定。