[发明专利]一种高效生产类克隆鸡的方法

权利要求书

1.一种高效生产类克隆鸡的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）、构建OCT4, SOX2, NANOG, LIN28四因子的慢病毒过表达载体并转染黑羽狼山鸡成纤维细胞CEF；

（2）、利用第一诱导培养基将转染四因子的狼山鸡成纤维细胞CEF诱导为iPSCs，在诱导的第5天细胞形态发生显著变化，逐渐聚集变圆，贴壁能力下降，此时将细胞转移至丝裂霉素处理后的CEF饲养层上培养，整个诱导过程持续21天；对诱导形成的iPSCs进行传代并进行鉴定；第一诱导培养基配方为Knockout DMEM、10%FBS、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1%非必需氨基酸、1000IU/mLLIF、10ng/mLbFGF、5ng/mL SCF、1%的青链霉素、2%鸡血清；

（3）、利用第二诱导培养基将诱导形成的iPSCs进行诱导分化为PGC-like，并通过PAS糖原染色、间接免疫荧光进行鉴定；第二诱导培养基配方为基础因子培养基、40ng/ml BMP4、40ng/ml BMP8b 、50ng/ml EGF；

（4）、收集PGC-like细胞并将其通过鸡胚血管注射的方法注射至孵化2.5天的隐性白羽鸡胚血管中，并通过冰冻切片方法确定PGC-like能够在受体隐性白羽鸡中的迁移归巢；

（5）、将注射黑羽狼山鸡PGC-like细胞的隐性白羽受体鸡胚继续孵化至至出壳，即，F0代；饲养至性成熟并进行相互交配，收集种蛋并进行孵化，获得黑羽后代，并通过微卫星技术证明黑羽后代来源于供体的PGC-like细胞，至此完成类克隆鸡的生产。

2.根据权利要求1所述的一种高效生产类克隆鸡的方法，其特征是，步骤（2）中，对诱导形成的iPSCs进行传代并通过间接免疫荧光、碱性磷酸酶染色以及染色体核型分析方法进行鉴定。

3.根据权利要求1所述的一种高效生产类克隆鸡的方法，其特征是，步骤（3）中，利用第二诱导培养基将诱导形成的iPSCs进行诱导分化为PGC-like，并通过PAS糖原染色和间接免疫荧光进行鉴定。