[发明专利]一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法

说明书

本发明涉及一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法，包括以下步骤：步骤（1）、在山中因子Oct4、Sox2、Klf4及c‑Myc诱导的基础上添加DNA甲基化酶抑制剂5’aza，按照山中伸弥提供的诱导方法对体细胞进行诱导，在不同诱导天数观察细胞形态；步骤（2）、当观察到出现细胞克隆时收集细胞进行荧光定量检测、间接免疫荧光检测、碱性磷酸酶染色、染色体核型分析和edu增殖检测；步骤（3）、确定5’aza的效果后，将四因子和5’aza分别进行组合处理体细胞进行诱导，检测ips克隆的形成，确定最有效的组合形式。通过本发明，通过山中因子和DNA甲基化抑制剂5’aza的不同组合诱导，探明DNA甲基化在体细胞重编程诱导中的作用。

技术领域

本发明涉及一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法，属于生物技术领域。

背景技术

细胞重编程是逆分化的一种过程，通过体细胞核移植、转录因子诱导、细胞融合、细胞质孵育等手段，可以将分化完全的体细胞重编程为全能性细胞。体细胞核移植通过收集体细胞核注入去核的卵母细胞中，将融合后的细胞进行体外培养至胚胎进而植入母体，获得克隆动物。这种方法切实有效且能真实产生后代，但其在一定程度上违反了伦理道德，无法在人类上利用。细胞融合手段主要在植物育种和制备单克隆抗体时应用广泛，而在动物中仍涉及伦理道德问题。而自2006年山中伸弥发现体细胞导入四个转录因子（Oct4，Sox2，Klf4及c-Myc），可重编程为诱导性多能干细胞后，转录因子诱导技术不断发展。其无需使用卵细胞和胚胎，而仅适用人体其他细胞即可获得多能干细胞的优势免除了伦理争议，因此广受关注。而其仅从转录因子的角度研究了体细胞重编程的因素，大量调控因子尚未被挖掘。研究表明，添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA后，显著提高重编程过程，仍有相当多的表观遗传因子有待挖掘。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有问题，DNA甲基化作为表观遗传修饰的一种，广泛存在于各个生命过程中。在体细胞中多能性基因往往处于高甲基化状态，表达抑制以维持体细胞稳定，而多能干细胞中DNA甲基化水平大多处于低甲基化状态，多能性基因活跃。因此DNA甲基化无疑决定着体细胞重编程的命运，然而目前尚未有报道系统地研究DNA甲基化对体细胞重编程的调控，仍需进一步研究。通过本发明，提供一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法。

本发明的技术方案是：一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤（1）、在山中因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc诱导的基础上添加DNA甲基化酶抑制剂5’aza，按照山中伸弥提供的诱导方法对体细胞进行诱导，在不同诱导天数观察细胞形态；

步骤（2）、当观察到出现细胞克隆时收集细胞进行荧光定量检测、间接免疫荧光检测、碱性磷酸酶染色、染色体核型分析和edu增殖检测；

步骤（3）、确定5’aza的效果后，将四因子和5’aza分别进行组合处理体细胞进行诱导，按步骤（2）中方法检测ips克隆的形成，确定最有效的组合形式；

在此基础上，单独使用5’aza进行诱导，按步骤（2）中方法检测ips克隆形成，进一步确定DNA甲基化抑制剂的单独诱导作用；从而有效探明DNA甲基化在重编程过程中的作用。

步骤（2）中，荧光定量检测的方法为：收集克隆样细胞，添加Trizol 裂解液，进行RNA提取，反转录为cDNA后，实时荧光定量PCR检测Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的表达，同时检测多能性基因的表达以及体细胞标记基因的表达；

间接免疫荧光检测方法为：去除细胞培养孔板中的培养基，添加4%的多聚甲醛对细胞固定30min，PBS清洗后，0.1%的Triton 透膜处理15min，离心清洗后，封闭2h，加入Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，全能性标记蛋白和体细胞标记抗体，孵育过夜，清洗后，加入二抗孵育2h，清洗后加入DAPI孵育10min，荧光倒置显微镜下观察标记蛋白的表达；