[发明专利]一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法

权利要求书

1.一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤（1）、在山中因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc诱导的基础上添加DNA甲基化酶抑制剂5’aza，按照山中伸弥提供的诱导方法对体细胞进行诱导，在不同诱导天数观察细胞形态；

步骤（2）、当观察到出现细胞克隆时收集细胞进行荧光定量检测、间接免疫荧光检测、碱性磷酸酶染色、染色体核型分析和edu增殖检测；

步骤（3）、确定5’aza的效果后，将四因子和5’aza分别进行组合处理体细胞进行诱导，按步骤（2）中方法检测ips克隆的形成，确定最有效的组合形式；

在此基础上，单独使用5’aza进行诱导，按步骤（2）中方法检测ips克隆形成，进一步确定DNA甲基化抑制剂的单独诱导作用；从而有效探明DNA甲基化在重编程过程中的作用。

2.根据权利要求1所述的一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法，其特征是，步骤（2）中，荧光定量检测的方法为：收集克隆样细胞，添加Trizol 裂解液，进行RNA提取，反转录为cDNA后，实时荧光定量PCR检测Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的表达，同时检测多能性基因的表达以及体细胞标记基因的表达；

间接免疫荧光检测方法为：去除细胞培养孔板中的培养基，添加4%的多聚甲醛对细胞固定30min，PBS清洗后，0.1%的Triton 透膜处理15min，离心清洗后，封闭2h，加入Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，全能性标记蛋白和体细胞标记抗体，孵育过夜，清洗后，加入二抗孵育2h，清洗后加入DAPI孵育10min，荧光倒置显微镜下观察标记蛋白的表达；

碱性磷酸酶染色方法为：吸去培养基,PBS清洗干净后加入ALP固定液，固定3 min，PBS清洗后，加入ALP孵育液，避光15-20 min，PBS清洗；加入核固红染色或甲基绿染色3-5min，PBS清洗后进行镜检，观察克隆细胞能否呈现碱性磷酸酶活性；

染色体核型分析方法为：将细胞克隆按5×10⁶的细胞接种在100mm口径培养皿中，至对数期，加入0.2ml的10μmol/L秋水仙酰胺，培养4h后，弃去培养基，加入胰蛋白酶孵育3min，加入10%FBS的DMEM终止消化，离心后，加入40mmol/L KCl和25mmol/L枸橼酸钠的低渗液重悬，静置后，加入等体积新鲜配制的冰冷的1:3醋酸甲醇固定液，静置10min，立新10min后，醋酸甲醇溶液重悬；用巴氏吸管吸一滴细胞悬液，从3米处滴在用冰块透凉的载玻片中；烘干后进行吉姆萨染色，5min后冲掉染液，观察染色体核型；

edu增殖检测方法为：取对数生长的细胞克隆，每孔1×10⁵细胞接种于96孔板中，持续培养；每孔加入50μM Edu培养基孵育2小时，弃培养基，PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室温孵育30min，弃固定液；加入甘氨酸孵育5min，清洗后加入0.5% TritonX-100的PBS孵育10min；清洗后加入1× Apollo®染色反应液，避光孵育10min，弃反应液，加入0.5% TritonX-10的PBS清洗2-3次，甲醇清洗1-2次，Hoechest 33342反应液孵育30min，PBS清洗后，进行观察。