[发明专利]一种噬菌体高滴度培养方法与应用

说明书

本发明提供一种T7噬菌体高滴度培养方法及其应用。本发明利用基因工程操作方法构建表达gene17.5串联gene19.5编码蛋白的重组大肠杆菌作为补偿宿主，再通过反向遗传方法在补偿宿主中拯救出gene17.5、gene19.5双基因缺失株噬菌体，双基因缺失T7噬菌体感染补偿宿主后在宿主内复制、富集，并在诱导gene17.5、19.5编码蛋白表达后裂解宿主。通过推迟宿主的裂解时间，增加噬菌体在宿主内的复制循环次数达到高滴度培养目的。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种噬菌体高滴度培养方法及应用，更具体地，涉及补偿宿主的构建、gene17.5、gene19.5双基因缺失T7噬菌体反向遗传拯救，并在此基础上建立噬菌体高滴度培养方法。

背景技术

噬菌体是侵染细菌的病毒，其识别宿主具有高度的特异性，其结构简单、基因数量少、容易被多元化群体操纵，因此成为分子生物学研究的重要模型系统。一个噬菌体颗粒可以杀灭数十亿个细菌，这种强大的杀菌能力使其有望成为抗生素替代品而备受关注。1985年G.P Smith创立了噬菌体表面展示技术，该技术可将外源蛋白的基因型和表型、蛋白质分子活性和噬菌体的可繁殖性有机结合。目前，噬菌体展示技术被广泛应用于疾病的诊断和治疗、蛋白分子互作、抗原表面筛选、细胞信号传导、抗体工程和新型疫苗研制等领域。解析噬菌体生命活动周期，尤其是噬菌体复制循环次数与启动宿主细菌裂解之间的调控关系，探索是否可以通过延长宿主裂解时间、增加复制循环数的方式在细菌内累积更多子代噬菌体颗粒、提高噬菌体繁殖滴度，对于廉价生产噬菌体类产品具有重要意义。

除温和型噬菌体外，烈性噬菌体均以裂解宿主的方式完成一个营养生长周期，进而释放子代粒子开始新一轮侵染。前期研究表明，多数双链DNA噬菌体均采用“穿孔素(Holin)-溶菌酶(Endolysin)”的二元系统裂解宿主细菌。Ry Yong等人最新研究表明，双链DNA噬菌体裂解过程包含三个步骤：穿孔素合成后在细胞膜上聚集，在特定时间点突然形成跨膜孔；溶菌酶通过跨膜孔切割内、外膜之间的肽聚糖(PG，peptidoglycan)；Spanin通过构象改变使细菌内、外膜融合，形成裂解碎片最终裂解细菌。随着对噬菌体分子结构和基因功能的解析、对溶菌机制认识的深入和明确，发现不同噬菌体的裂解方式存在一定差异。参与裂解宿主的重要蛋白分子：Holin、Endolysin、Spanin均有两种形式，理论上可以组合成8种裂解宿主的方式，目前仅其中的6种裂解方式找到对应的噬菌体。大多数噬菌体的裂解方式只是建立在基因比对分析后的理论推测，并未有明确的实验证实。

公开于该背景知识的信息旨在增加对该发明的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种噬菌体高滴度培养方法。本发明首先构建表达gene17.5、gene19.5的重组大肠杆菌作为补偿宿主，检验表达产物对宿主损伤作用；再经反向遗传方法在补偿宿主内拯救出缺失gene17.5、gene19.5的重组噬菌体(命名为T7-delgene17.5/19.5)；进一步地，本发明还优化该双基因缺失噬菌体在补偿宿主内高滴度培养的工艺参数，最终确定T7噬菌体高滴度培养方法，实现子代噬菌体数量显著提高。利用建立的方法培养表面展示口蹄疫病毒VP1抗原的重组噬菌体，证明该方法具有应用前景。

为了实现上述目的，本发明提供一种T7噬菌体高滴度培养方法，该方法包括：

步骤I.构建诱导表达gene17.5、gene19.5编码蛋白的补偿宿主；gene17.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，gene19.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示；