[发明专利]一种噬菌体高滴度培养方法与应用

权利要求书

1.一种T7噬菌体高滴度培养方法，其特征在于，该方法包括：

步骤I.构建诱导表达gene17.5、gene19.5编码蛋白的补偿宿主；gene17.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，gene19.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示；

步骤II.通过反向遗传方法在补偿宿主内拯救gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体；

步骤III.通过诱导gene17.5和gene19.5编码蛋白的表达实现对补偿宿主裂解过程的控制；通过推迟补偿宿主起始裂解的时间点，增加双基因缺失株T7噬菌体在胞内的复制循环次数，从而实现T7噬菌体的高滴度培养。

2.根据权利要求1所述的T7噬菌体高滴度培养方法，其特征在于，步骤I包括：

(1)以T7噬菌体基因组为模板，以引物F4/R4、F5/R5分别扩增gene17.5和gene19.5；通过引物在gene17.5上游引入NcoⅠ酶切位点，在gene19.5下游引入BamHⅠ酶切位点；

F4：5’-agaCCATGGtgGTGCTATCATTAGACT-3’(SEQ ID NO：3)

R4：5’-GCGGAACATGTGATGATGATGATGATGTCACTCCTTATTGGCTTTCTT-3’(SEQ ID NO：4)

F5：5’-AGGAGTGACATCATCATCATCATCACATGTTCCGCTTATTGTTGAAC-3’(SEQ ID NO：5)

R5：5’-agaGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGCTAATCGCTACA-3’(SEQ ID NO：6)

(2)以gene17.5和gene19.5为模板，通过引物F4/R5，经SOE-PCR方法将二者串联，得到串联基因；

(3)通过NcoⅠ和BamHⅠ位点将串联基因插入pET-28a重组质粒载体，得到重组质粒；

(4)将重组质粒转化大肠杆菌BL21，构建补偿宿主，采用IPTG诱导gene17.5和gene19.5编码蛋白的表达。

3.根据权利要求1所述的噬菌体高滴度培养方法，其特征在于，步骤II包括：

(1)提取T7噬菌体基因组，SfiⅠ单酶切，电泳鉴定，切胶回收酶切位点左侧34kb基因片段；

(2)以T7噬菌体基因组为模板，以引物F1和R1，PCR扩增SfiⅠ酶切位点至gene17.5之间的片段S1，以引物F2和R2扩增gene17.5下游至gene19.5上游之间的片段S2；以引物F3和R3扩增gene19.5下游至T7噬菌体基因组右侧末端之间的片段S3，通过SOE-PCR将S1、S2和S3片段串联，得到串联片段并经SfiⅠ单酶切；

F1：5’-ataGGCCGTTGTGGCCACTGATGGTA-3’(SEQ ID NO：7)

R1：5’-CTTATCCTTTTCCATACATACTTGTACCTCCTTGAGAGT-3’(SEQ ID NO：8)

F2：5’-ACTCTCAAGGAGGTACAAGTATGTATGGAAAAGGATAAG-3’(SEQ ID NO：9)

R2：5’-ATCAGTCGGTCAGGAAGACCGAGTCTCCTCCCTTTATGTT-3’(SEQ ID NO：10)

F3：5’-AACATAAAGGGAGGAGACTCGGTCTTCCTGACCGACTGAT-3’(SEQ ID NO：11)

R3：5’-AGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAA-3’(SEQ ID NO：12)

(3)将酶切回收的T7噬菌体基因组SfiⅠ位点左侧片段和同酶处理的串联片段进行连接，连接产物导入补偿宿主，拯救得到gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体。