[发明专利]一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其应用

说明书

本发明公开了一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其应用，涉及植物细胞技术领域，该重组载体为pGm109‑35S‑GmPti5重组载体，包括植物双元表达载体pGM109和GmPti5基因；GmPti5基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。公开了该重组载体在构建抗蚜虫大豆株系中的应用。还公开了一种可提高大豆蚜虫抗性基因在构建抗蚜虫大豆株系中的应用，该基因为GmPti5基因，编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了调控大豆对蚜虫抗性的基因GmPti5，构建重组载体，该基因过量表达能够提高大豆对于蚜虫的抗性，能减少农药及人力的投入，保证大豆产量的稳定性，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及植物细胞技术领域，尤其涉及一种可提高大豆蚜虫抗性的基因的重组载体及其应用。

背景技术

蚜虫是大豆生产中所遇到的主要虫害之一，也是影响大豆产量的重要原因。提高大豆对蚜虫的天然抗性不仅能保证大豆的正常生长，还能减少农药及人力的投入，保证大豆产量的稳定性。目前生产上尚未出现抗蚜虫的大豆品种，对大豆蚜虫的防治仍主要通过化学防治进行。因此提高大豆自身对蚜虫的抗性是大豆生产中亟待解决的重要问题。

不同大豆品种对蚜虫抗性存在很大差异，抗虫品种具有更高的蚜虫抵抗能力。发掘和利用大豆中抗蚜虫的关键基因，对于培育抗蚜虫大豆品种具有重要意义。

因此，本领域的技术人员致力于发现及克隆可提高大豆蚜虫抗性基因，并开发一种过量表达乙烯响应因子及其编码产物提高大豆对蚜虫抗性的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种过量表达乙烯响应因子及其编码产物提高大豆对蚜虫抗性的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其在构建抗蚜虫大豆株系中的应用方法；提供了一种可提高大豆蚜虫抗性基因及其在构建抗蚜虫大豆株系中的应用方法。

本发明提供一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体，为pGm109-35S-GmPti5重组载体，pGm109-35S-GmPti5重组载体包括植物双元表达载体pGM109和GmPti5基因；GmPti5基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，植物双元表达载体pGM109中包括花椰菜花叶病毒35S启动子、Nde I和Sal I位点；Nde I和Sal I位点位于花椰菜花叶病毒35S启动子之后；GmPti5基因正向插入在Nde I和Sal I位点之间。

本发明还提供一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体在构建抗蚜虫大豆株系中的应用。

该重组载体在构建抗蚜虫大豆株系中应用的方法包括以下步骤：

步骤1、合成大豆第一链cDNA：提取抗蚜虫大豆品种总RNA后反转录，获得第一链cDNA，以第一链cDNA为模版，进行第一PCR扩增，得到扩增产物GmPti5基因全长cDNA；

步骤2、构建过表达重组载体pGm109-35S-GmPti5，以步骤1获得的GmPti5基因全长cDNA为模版，用含有Nde I和Sal I接头的特异性引物进行第二PCR扩增，得到第二扩增产物，第二扩增产物经过Nde I及Sal I双酶切，回收后得到双酶切产物，将双酶切产物正向插入植物双元表达载体pGM109的花椰菜花叶病毒35S启动子之后的Nde I和Sal I位点之间，得到重组载体pGm109-35S-GmPti5；

步骤3、将步骤2得到的重组载体pGm109-35S-GmPti5通过农杆菌介导的子叶节法转化到大豆易感蚜虫材料中，得到转化后的大豆易感蚜虫材料；转化后的大豆易感蚜虫材料经过共培养、芽诱导、生根培养、种植，得到转基因大豆；对转基因大豆转化筛选，并分析表达量，得到阳性株系；对阳性株系连续筛选，获得稳定遗传的抗蚜虫大豆材料。

进一步地，第一PCR扩增引物序列为：