[发明专利]一种同时检测石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的方法

说明书

本发明属于生物碱类物质检测技术领域，提供了一种同时检测石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的方法。包括以下步骤：将待测石蒜属植物样品和提取剂混合，进行提取，得到上机样品；将所述上机样品进行液相色谱串联二级质谱检测；本发明利用液相色谱串联二级质谱检测及选择的14种物质的母离子信息监测，能够提高14种代谢物的定性及定量分析的准确性。

技术领域

本发明涉及生物碱类物质检测技术领域，具体涉及一种同时检测石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的方法。

背景技术

石蒜属(Lycoris spp.)是石蒜科(Amaryllidaceae)球根草本植物，很多品种石蒜是中国特有的观赏和药用花卉，富含多种石蒜属植物特有的生物碱成分，药用价值极高。因此，对石蒜中生物碱含量进行准确定性和定量分析是育种和生物碱类物质合成代谢研究的重要内容之一。

包括加兰他敏在内的许多植物次生代谢产物在植物中的含量较低且资源有限，这极大的限制了这类具有极高药用价值的植物天然产物的商业化应用。因此探索代谢工程的方法来生产加兰他敏等生物碱，将为药用植物资源保护和可持续开发利用提供新的思路，同时也具有较好的经济和社会价值，而这些工作的关键前提是探明石蒜加兰他敏生物合成途径。

迄今为止，研究认为石蒜属加兰他敏等生物碱合成途径可以分为4大步骤：初始合成反应、降孤挺花啶(Norbelladine)骨架的形成、酚环化反应及不同生物碱亚组骨架的形成和核心骨架结构的修饰。初始步骤反应底物来源于初生代谢产生的苯丙氨酸(L-phenylalanine)和酪氨酸(L-tyrosine)。在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的作用下，苯丙氨酸转化为反式桂皮酸(trans-cinnamic acid)，再经过两步可能由细胞色素P450家族酶催化的羟基化(肉桂酸-4-羟化酶Ca₄H，肉桂酸-3-羟化酶Ca₃H)反应，及后续的脱C反应，生成3,4-二羟基苯甲醛(3,4-Dihydroxybenzaldehyde；3,4-DHBA)。在酪氨酸脱羧酶(TYDC)的作用下，酪氨酸转化为酪胺(tyramine)。3,4-DHBA和tyramine经过缩合和还原反应，最终生成降孤挺花啶(Norbelladine)。Norbelladine在氧位甲基转移酶(O-methytransferase，OMT)的催化下接受一个甲基基团转变为4’-O-甲基降孤挺花啶(4’-O-methylnorbelladine)，作为整个合成途径的核心中间产物，4’-O-methylnorbelladine是石蒜科多种生物碱的共同前体。再经过可能由细胞色素P450家族酶催化的邻-对、对-邻或对-对位的氧化性C-C酚环化反应，4’-O-methylnorbelladine可生成石蒜碱型(Lycorine-type)、加兰他敏型(Galanthamine-type)和水仙环素型(Narciclasine-type)三种生物碱骨架结构；这些结构再经过复杂的O-甲基化、N-甲基化、C-C和C-O键形成、氧化还原、去甲基化和羟基化修饰反应，最终生成结构各异的生物碱类化合物。研究表明，加兰他敏的合成是按照4’-O-甲基降孤挺花啶(4’-O-methylnorbelladine)、N-去甲基那维定(N-Demethylnarwedine)、N-去甲基加兰他敏(N-Demethylgalanthamine)、加兰他敏(Galanthamine)的路线进行。

现有技术中，未发现针对加兰他敏合成途径代谢物即苯丙氨酸、4-羟基桂皮酸、4-羟基苯甲醛、3,4-二羟基肉桂酸、反式桂皮酸、酪氨酸、酪胺、3,4-二羟基苯甲醛、降孤挺花啶、4’-O-甲基降孤挺花啶、去甲基加兰他敏、加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏同时检测，准确定量的方法，为生物碱类物质的快速定量分析带来不便。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的方法。本发明提供的方法实现了快速定量分析石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：