[发明专利]一种具有底物选择性的肽组装水解酶的制备方法

说明书

本发明涉及一种具有底物选择性的肽组装水解酶的制备方法。利用短肽自组装得到模拟酶的活性位点；利用聚合物单体与交联剂及模板分子在肽组装纳米纤维表面得到聚合物；除去模板后，聚合物中获得了与模板分子互补的空腔，得到了具有底物选择性的肽组装水解酶。通过本发明的方法得到的肽组装人工水解酶实现了对模板底物更高的催化能力，并且可通过改变模板分子种类实现可定制的底物选择性。

技术领域

本发明涉及一种具有底物选择性的肽组装模拟酶的制备方法，特别是一种具有底物选择性的肽组装水解酶的制备方法，属于化学和生物催化领域。

背景技术

天然酶是一类具有生物催化活性的天然高分子物质，绝大多数天然酶是由蛋白质组成，其具有由精确的氨基酸序列形成的多级结构。然而，天然酶分离纯化困难、很容易受到反应环境的影响而失活，成本高、在一些特定的工业反应过程中往往不能满足应用要求。为了克服天然酶的局限性，人工模拟酶逐渐成为一个备受瞩目的研究热点，其中通过自组装多肽制备的肽组装模拟酶具有许多独特的优势。首先，肽组装材料具有高度可设计性，肽链序列可以通过对不同氨基酸的排列组合设计出多种结构和催化功能。其次，肽组装的驱动力是非共价相互作用(如氢键、范德华力、疏水相互作用、π-π堆积等)，这些相互作用类似天然酶分子的折叠弯曲。此外，短肽通过非共价相互作用形成的超分子结构也为模拟酶的活性中心提供了疏水微环境，这有助于提高模拟酶的催化活性。

底物特异性是天然酶的一个重要特征。天然酶可以通过独特的底物结合位点进行分子识别，从而专一性的催化一种或一类底物进行反应。但是由于肽组装材料结构较为简单，不易形成对底物具有识别和结合能力的位点，这导致肽组装模拟酶虽然具备天然酶的催化活性，但却无法实现对如天然酶的对底物的选择性。因此，制备具有特定底物选择性的肽组装模拟酶仍是一个巨大的挑战。

分子印迹是一种在合成聚合物中产生选择性识别位点的工程化方法。该技术需要在模板分子存在下聚合功能单体。当模板被除去后，获得的分子印迹聚合物(MIP)具有特定的空腔，可与模板分子在形状、大小和基团上实现互补，从而形成可定制的结合位点。因此，所制备的MIP具有重新结合目标分子的能力，并且表现出令人满意的选择性，使得分子印迹被认为是构建模拟酶底物结合位点的有效方法。

因此，通过简单的制备工艺，将分子印迹技术与肽组装模拟酶结合，获得具有对特定底物具有选择性的肽组装模拟酶，可为实现人工酶专一性催化提供新方法和新思路。

发明内容

针对现有肽组装模拟酶底物选择性差的不足，本发明提供一种具有底物选择性的肽组装模拟酶的制备方法，特别是一种具有底物选择性的肽组装水解酶的制备方法。具体技术方案如下：

本发明的基于分子印迹的肽组装水解酶的制备方法，包括如下步骤：

1)配制含短肽和印迹模板分子的混合液，超声分散，逐滴加入至氮气吹扫后的含有聚合物单体、交联剂、光引发剂的溶液中稀释，漩涡震荡，得到透明无色的混合物水凝胶，室温下避光静置一段时间后，在紫外光照射下开始聚合反应；

2)聚合结束后，离心收集产物，加入氢氧化钠溶液以降解印迹模板，加超纯水并反复除去上清液。将沉淀物用液氮速冷冻结，在真空干燥机中干燥，得到对特定底物具有选择性的肽组装人工水解酶。

优选的，所用的短肽为含组氨酸残基的2-10肽。

优选的，所用的印迹模板分子为肽组装水解酶预期催化底物：如对硝基苯酚乙酸酯(p-NPA)，对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)，对硝基苯酚己酸酯(p-NPH)等。

优选的，所用的聚合物单体为丙烯酰胺(Am)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)，交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBAm)，引发剂为偶氮二异丁脒盐酸盐(V-50)。

优选步骤1)所述的短肽和印迹模板分子混合液，其中短肽浓度为10～100mmol/L，模板分子浓度为5～30mmol/L。