[发明专利]一种IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法

说明书

本发明针对IgG2型抗体分子三种二硫键异构体的结构、电荷上的差异，在对各种蛋白分离纯化方法进行反复尝试和结果验证的基础上，最终成功的以CEX‑HPLC半制备液相色谱实现了对IgG2的二硫键异构体的拆分，进一步结合高分辨率RP‑HPLC色谱和LC‑MS鉴定、生物学活性分析，提供了一种保留生物学活性的IgG2型抗体二硫键异构体分离和制备方法。结果表明本发明的方法能够将IgG2型抗体成功拆分为IgG A、IgG B、IgG AB，并且拆分过程中避免了极端物理条件和溶剂体系，有效的保持了IgG2型抗体的生物学活性。

技术领域

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种IgG2型抗体二硫键异构体的拆分和鉴定方法，特别是涉及利用CEX-HPLC半制备液相色谱、RP-HPLC和LC-MS对IgG2抗体的二硫键异构体进行拆分和鉴定。

背景技术

IgG的二硫键结构建立于20世纪60年代。这些二硫键结构被称为经典的二硫键结构，因为它们被广泛接受。然而，大量IgG分子的详细表征揭示了重组和天然人IgG抗体中的几种新结构特征。尽管半胱氨酸残基应处于二硫键键合状态，但已在IgG抗体的所有亚类中检测到游离巯基。此外，二硫键易受化学修饰的影响，其可进一步产生结构变体，例如具有三硫键(trisulfide)或硫醚键(thioether)的IgG抗体。还观察到所有亚类的IgG形成三硫键。通过β-消除降解二硫键产生游离巯基二硫化物和脱氢丙氨酸。游离巯基和脱氢丙氨酸之间的进一步反应导致形成不可还原的交联物质。脱氢丙氨酸残基的水解有助于抗体铰链区(hinge region)的片段化。因此，这些二硫键变化对抗体结构，稳定性和生物学功能造成不期望的影响。

IgG2型分子重轻链是通过轻链的LC215同重链的HC136形成二硫键，两条重链通过各自的HC224、HC225、HC228及HC231间形成四对二硫键而构成四聚体。由于空间位置接近，IgG2分子二硫键会发生重排，LC215可同HC224间形成二硫键而重链上的HC136则可同HC224或HC225间形成二硫键，如图1所示。

三种异构体分别命名为IgG2-A、IgG2-A/B及IgG2-B，其中IgG2-A/B为中间体。由于二硫键位置上的影响导致各异构体″压缩″程度上存在差异，表现为表观分子量上存在微弱的差异。抗体样品非还原CGE分析可检测到IgG2-A、IgG2-B两个异构体。有文献报道(Structural and Functional Characterization ofDisulfideIsoforms of the HumanIgG2 Subclass THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY VOL.283，NO.23，pp.16206-16215，June 6，2008)IgG2亚型抗体的二硫键异构体在半胱氨酸/胱氨酸体系中二硫键会发生重排，从而促使异构体间互相转变。在半胱氨酸/胱氨酸缓冲体系中，IgG2-A趋向于形成IgG2-B；当缓冲体系中加入适量的变性剂如盐酸胍，IgG2-B趋向于形成IgG2-A。

尽管通常的抗体纯化方法是本领域常规技术手段，但IgG2抗体的生产实践中，通过常规的蛋白质纯化方法难以拆分IgG2抗体的二硫键异构体，HPLC色谱常出现双峰、前带、后带等现象。对于治疗性抗体药物而言，抗体分子结构上的不均一不仅影响药物的稳定性、削弱治疗性能，甚至有可能带来不期望的不良反应，在通过药品审批的过程中也会带来更多的困难。因此，迫切需要提供一种针对IgG2型抗体分子二硫键异构体的纯化方法，以提高抗体分子结构的均一性和生物功能的稳定性。