[发明专利]一种钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述试剂盒包括如下组分：CYP3A5*3扩增引物、CYP3A5*3测序引物、NPPA(T2238C)扩增引物、NPPA(T2238C)测序引物和阳性对照。本发明通过多重RPA一管扩增CYP3A5*3、NPPA(T2238C)，快速、有效地在恒定温度下产生大量扩增产物。通过直接与羧基修饰素结合的氨基标记单链DNA特异捕获单链DNA，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤，简化了测序处理的流程和时间。

技术领域

本发明涉及一种钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

背景技术

目前临床常用的抗高血压药物有5大类：利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂。药物在体内代谢过程中涉及到多种药物代谢酶、转运体和受体，它们存在的基因多态性最终导致了患者以相同方式服用同种药物时，其治疗效果、产生的不良发展及其对药物的耐受性等方面存在明显的个体差异。

钙离子拮抗剂是通过阻滞钙通道来降低血压的化学制剂。它可以选择性抑制 Ca2+经细胞膜上的钙通道进入细胞内，具有扩张血管和负性肌力作用，松弛血管平滑肌，减少末梢血管阻力，从而降低血压，但脑、冠状动脉和肾血流量不减少。硝苯地平、氨氯地平是常用的治疗高血压的钙离子拮抗剂。研究表明，NPPA基因 T2238C多态性会影响利尿剂和钙离子拮抗剂的药物疗效。但是该基因在中国人群中突变频率较低。据报道，中国人群中CACNA1C基因的的rs2238032G/T位点GG型患者4周末收缩压和舒张压降幅均显著低于TT或GT型△SBP4.0±11.6mmHg vs.19.9±14.1mmHg，p＝0.007；△DBP﹣2.2±4.5mmHg vs.9.9±8.9mmHg，p＝0.005)， GG型患者增加氨氯地平服药剂量或者加用其它降压药物才能使血压达标。

CYP3A家族是人体内介导药物代谢最多的药物代谢酶，50％以上临床常用药物的氧化、还原反应都通过CYP3A4和CYP3A5催化来完成。钙离子拮抗剂主要通过 CYP3A5酶代谢。CYP3A5的表达与活性呈高度多态性，存在广泛的个体及种族间差异。其中CYP3A5*3(A6986G，intron3)基因型较常见，中国人约65％～73％。CYP3A5 的基因突变是酶活性产生差异的主要原因，CYP3A5突变使其酶活性显著下降，底物药物代谢减缓，药物作用及毒副反应明显增加。研究表明，CYP3A5*3基因型降低了氨氯地平清除率，增加了降压疗效。

目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用 ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为基础，获得一种钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：

本发明的检测试剂盒针对CYP3A5*3、NPPA(T2238C)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增试剂1、扩增试剂2、CYP3A5*3测序引物、NPPA(T2238C)测序引物、阳性对照。

优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：