[发明专利]一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR‑nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用。本发明首先利用生物信息学方法确定需要保留的必需基因及可以删除的非必需基因，选择一段长度为10Kb的非必须基因作为目标敲除大片段。然后在目标基因序列的编码链和模板链上各设计一个spacer序列，两个由spacer序列转录并加工出的crRNA搭配经过改造后的nCas3单链核酸内切酶共同作用，完成对目标DNA序列双链的破坏。最后将人工CRISPR簇和供体DNA序列组装到载体上，通过电穿孔转化到运动发酵单胞菌细胞内完成编辑。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用。

背景技术

近年来，利用微生物进行代谢工程、系统生物学及合成生物学等方面的研究取得了良好的进展，为理性化设计、构建微生物细胞工厂，利用生物体活细胞或酶对可再生生物质，如纤维素等进行物质转化，生产生物能源，实现生物冶炼的工业化提供了重要的理论基础。生物能源再生化是解决人类目前面临的资源、能源短缺及环境污染严重等问题的有效手段之一。

CRISPR-Cas是一种广泛存在于大多数细菌和古菌中的原核适应性免疫系统，用于防止病毒或质粒等外源性遗传物质的入侵。该系统由RNA引导，CRISPR序列内储存的遗传信息会转录出具有特异性RNA，与Cas核酸酶结合后会在外源入侵遗传物质的位点特异性结合，产生双链断裂并刺激宿主的修复机制，包括同源重组修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。这种细菌保有的免疫修复机制目前已经被开发用来作为生命科学领域常用的一种基因编辑工具。

高效、易于操作的基因组编辑工具的匮乏，严重阻碍了对具有良好微生物细胞工厂特性的运动发酵单胞菌的细胞学性质研究，以及对其生物能源生产优势等方面的有效利用。本发明将开发运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统构建基因组编辑平台，打破外源CRISPR-Cas基因组编辑工具无法在该类菌株中应用的限制，为在该菌株及类似细胞中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明的目的在于利用运动发酵单胞菌其自身基因组编码的I-F型CRISPR-Cas系统作为基础加以改造，对其自身基因组上的大片段进行了敲除。为在该菌株及类似细胞中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。

本发明首先利用生物信息学方法确定需要保留的必需基因及可以删除的非必需基因，选择一段长度为10Kb的非必须基因作为目标敲除大片段。然后在目标基因序列的编码链和模板链上各设计一个spacer序列，两个由spacer序列转录并加工出的crRNA搭配经过改造后的nCas3单链核酸内切酶共同作用，完成对目标DNA序列双链的破坏。最后将人工CRISPR簇和供体DNA序列组装到载体上，通过电穿孔转化到运动发酵单胞菌细胞内完成编辑。

本发明是这样实现的，一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，包括序列如SEQ ID NO.16所示的人工CRISPR簇、编辑质粒载体和含nCas3单链核酸内切酶的工程菌；

所述nCas3单链核酸内切酶为在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引发突变，使野生型Cas3蛋白丧失解旋酶活性，只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白。

进一步地，所述野生型Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述nCas3单链核酸内切酶为K458A、或D608A、或R887A；

所述K458A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第458位的“K”替换为“A”；