[发明专利]一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用

权利要求书

1.一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，其特征在于：包括序列如SEQ ID NO.16所示的人工CRISPR簇、编辑质粒载体和含nCas3单链核酸内切酶的工程菌；

所述nCas3单链核酸内切酶为在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引发突变，使野生型Cas3蛋白丧失解旋酶活性，只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白；所述野生型Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述nCas3单链核酸内切酶为K458A、或D608A、或R887A；

所述K458A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第458位的“K”替换为“A”；

所述D608A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第608位的“D”替换为“A”；

所述R887A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第887位的“R”替换为“A”。

2.根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，其特征在于：所述含nCas3单链核酸内切酶的工程菌为运动发酵单胞菌。

3.根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统，其特征在于：所述编辑质粒载体pEZ15a载体。

4.如权利要求1-3任一所述的一种基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统在基因编辑中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因编辑包括基因敲除、定点突变、插入中的任一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述基因敲除包括基因组大片段删除。

7.一种利用如权利要求1-3任一所述的基于运动发酵单胞菌的CRISPR-nCas3基因编辑系统进行基因组大片段删除的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将人工CRISPR簇和编辑质粒载体连接，构建编辑质粒；

S2：根据待删除的目标片段序列设计并制备原间隔序列，

S3：将目标片段的原间隔序列与编辑质粒连接后，转化至含nCas3单链核酸内切酶的工程菌中培养。