[发明专利]一种粪肠球菌保存方法及冷冻保存用保存剂

说明书

本发明涉及一种粪肠球菌保存方法及冷冻保存用保存剂，该方法包括以下步骤：(1)菌液制备：将粪肠球菌接种到含有培养基的容器中，静置培养；(2)第一次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；(3)第二次传代；(4)第三次传代；(5)分装保存：将培养后的菌液离心，并去掉上清液后，向菌泥加入保存剂，混合均匀，放置一段时间后，低温保存。该保存剂包含以下质量百分比组分：甘油18‑20％，氯化物4‑5％，磷酸氢二盐0.5‑0.56％，磷酸二氢盐0.04‑0.1％，余量水，pH为8.5‑9.0。与现有技术相比，本发明操作简单，菌种稳定性强，能大幅提升冷冻保存后存活率。

技术领域

本发明涉及粪肠球菌保存领域，具体涉及一种粪肠球菌保存方法及冷冻保存用保存剂。

背景技术

粪肠球菌归于肠球菌属，革兰氏阳性菌，兼性厌氧。菌体为圆形或椭圆形，呈单个、成对或短链状排列，无芽孢、无鞭毛。是人及动物肠道中正常菌群的一部分，在肠黏膜上具有较强的耐受和定植能力，以及具有较强的抗逆性，能改善动物的生长性能。

粪肠球菌具有良好的抑菌能力和抗药敏性能，对肠系菌群具有调控作用，而且对致病型大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌等能起到较好的抑制作用。粪肠球菌广泛应用于制药、食品和饲料加工业。

粪肠球菌虽然有较强的抗逆性，但其作为乳酸菌无法形成芽孢，所以其保存的效果远不如芽孢杆菌，目前对于其菌种的保存主要以冷冻保存为主，冷冻保存时，降温过程中粪肠球菌的死亡率较高，导致其冷冻保存的存活率较低，同时也降低了其保存的时限，

而现有的技术一般只把重点放在保护剂配方原料上，却忽略了菌种本身抗逆性与保存工艺、保护剂参数等因素。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单，菌种稳定性强，能大幅提升冷冻保存后存活率的粪肠球菌保存方法及冷冻保存用保存剂。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种粪肠球菌冷冻保存用保存剂，该保存剂包含以下质量百分比组分：甘油18-20％，氯化物4-5％，磷酸氢二盐0.5-0.56％，磷酸二氢盐0.04-0.1％，余量水，pH为8.5-9.0。

进一步地，所述的氯化物包括氯化钠或氯化钾；所述的磷酸氢二盐包括磷酸氢二钾或磷酸氢二钠；所述的磷酸二氢盐包括磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。

一种粪肠球菌冷冻保存方法，该方法包括以下步骤：

(1)菌液制备：将粪肠球菌接种到含有培养基的容器中，静置培养；

(2)第一次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；

(3)第二次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；

(4)第三次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；

(5)分装保存：将培养后的菌液离心，并去掉上清液后，向菌泥加入保存剂，混合均匀，放置一段时间后，低温保存。

传代时，吸取的菌液体积为上一步骤混合液的10％左右，解冻后，吸取的菌液体积为另一个容器中液体体积的10％左右。

本发明的方法是专门针对粪肠球菌而设计的，经验证后，不具有普适性，没有证据能够证明这个培养、保存方法可以随意外推应用到别的菌种当中。

进一步地，所述静置培养的温度为37-38℃，时间为24-36h。