[发明专利]一种粪肠球菌保存方法及冷冻保存用保存剂

权利要求书

1.一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)菌液制备：将粪肠球菌接种到含有培养基的容器中，静置培养；

(2)第一次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；

(3)第二次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；

(4)第三次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；

(5)分装保存：将培养后的菌液离心，并去掉上清液后，向菌泥加入保存剂，混合均匀，放置一段时间后，低温保存。

2.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，所述静置培养的温度为37-38℃，时间为24-36h。

3.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，所述的培养基包含以下浓度份组分：蛋白胨8-10g/L，酵母浸粉4-5g/L，葡萄糖8-10g/L，乙酸钠4-5g/L，柠檬酸二铵1.6-2g/L，磷酸氢二钾1.6-2g/L。

4.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，传代时，从培养后的容器中吸取菌液与保护剂的体积相等。

5.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，所述的保护剂是质量浓度为18-20％的甘油溶液。

6.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻的温度为-80℃，步骤(2)中冷冻的时间为10-20min，步骤(3)中冷冻的时间为30-40min，步骤(4)中冷冻的时间为50-60min。

7.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，所述保存剂的体积为菌泥的4-5倍。

8.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌冷冻保存方法，其特征在于，所述离心转速为4000-5000r/min。时间为10-15min；所述放置的时间为20-30min，低温保存的温度为-80℃。

9.一种粪肠球菌冷冻保存用保存剂，其特征在于，该保存剂包含以下质量百分比组分：甘油18-20％，氯化物4-5％，磷酸氢二盐0.5-0.56％，磷酸二氢盐0.04-0.1％，余量水，pH为8.5-9.0。

10.根据权利要求9所述的粪肠球菌冷冻保存用保存剂，其特征在于，所述的氯化物包括氯化钠或氯化钾；所述的磷酸氢二盐包括磷酸氢二钾或磷酸氢二钠；所述的磷酸二氢盐包括磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。