[发明专利]一种nCas3单链核酸内切酶及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种nCas3单链核酸内切酶及其应用。本发明提供的nCas3单链核酸内切酶，通过破坏掉Ⅰ型系统中Cas3蛋白的解旋酶活性区域，使其成为只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白，达到在基因编辑过程中只在靶向位点切割其中一条DNA单链而不会对DNA分子内另一条单链造成损伤的目的。以此降低Cas3蛋白在基因编辑过程中对细胞的毒性，从而提高转化效率，获得更多的转化子，进而筛选得到更多编辑后的目的菌株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种nCas3单链核酸内切酶及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas是一种广泛存在于大多数细菌和古菌中的原核适应性免疫系统，用于防止病毒或质粒等外源性遗传物质的入侵。

近年来的研究证实，CRISPR-Cas系统在结构上由两部分组成。首先，是有规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPRs)，宿主可以在其中存储入侵的遗传物质信息。其次，是一些与CRISPR相关的蛋白质(Cas蛋白)。Cas蛋白包括由CRISPR相关基因编码的解旋酶、核酸酶和结构蛋白。当储存在CRISPR簇中的外源基因序列被转录加工成具有特定结构的pre-crRNA后，Cas蛋白会与crRNA结合，识别并切割入侵的外源基因序列。

目前，原核生物适应性免疫系统已被广泛应用于微生物学、分子生物学等多个领域。迄今为止，CRISPR-Cas系统的分类层次大体上总共分为两个大类和六个型。其中的1类系统，包括I型、III型和IV型，其特征是由多个Cas蛋白共同构成。Type I和Type III是最常见和多样化的，在大量的古细菌中都有存在，在细菌中则较少出现。IV型系统缺乏CRISPR-Cas基因座的适应模块。第2类系统，包括II型、V型和VI型，这类系统则是由一个单一的、大的、多结构域的Cas蛋白组成。每一种类型的CRISPR-Cas系统中都存在与之对应的特征蛋白。例如II型系统中具有核酸内切酶活性的效应蛋白Cas9和V型系统中的效应蛋白Cpf1。而在Ⅰ型系统中，特征效应蛋白则为Cas3蛋白。

Cas3蛋白是由cas3基因编码的一种多功能蛋白，同时具有单链DNA(ssDNA)刺激的ATP酶活性、ATP依赖的解旋酶活性和一种金属依赖的单链核酸酶活性。大多数情况下，其解旋酶结构域会与核酸酶结构域中位于Cas3蛋白的n端的HD位点融合，并参与目标DNA的裂解。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种nCas3单链核酸内切酶及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种nCas3单链核酸内切酶，所述nCas3单链核酸内切酶为在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引发突变，使野生型Cas3蛋白丧失解旋酶活性，只具备单链核酸酶活性的nCas3蛋白。

进一步地，所述野生型Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述nCas3单链核酸内切酶为K458A、或D608A、或R887A；

所述K458A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第458位的“K”替换为“A”；

所述D608A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第608位的“D”替换为“A”；

所述R887A的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于将第887位的“R”替换为“A”。

进一步地，所述nCas3单链核酸内切酶的氨基酸序列为由K458A、或D608A、或R887A的氨基酸序列经过若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入，且具有相同蛋白功能的氨基酸序列。

进一步地，所述野生型Cas3蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；