[发明专利]一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法

说明书

本发明涉及一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，该方法通过对外泌体单颗粒的动态成像和数字化分析，同时获取粒径及表面分子标志物信息，通过数据分析算法进行亚型的分类。首先，在金属芯片表面修饰识别分子，通过流体装置将该待测外泌体样品加入金属芯片表面的反应腔，通过高灵敏的显微成像系统及数据分析软件实现外泌体与分子相互作用过程的动态检测，构建外泌体粒径与分子标志物间的定量模型，实现亚型的聚类分析，解决了外泌体亚型分析中亚型样品分离困难的关键问题。

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，涉及一种基于表面等离子体共振成像的免分离的外泌体亚型分析方法。

背景技术

液体活检(Liquid biopsy)技术通过检测血液中的循环生物标志物等，用于实现对癌症患者的早期筛查、指导治疗方案、治疗监测和复发监控，是目前最具前景的癌症诊断和治疗工具之一。外泌体是由细胞分泌的直径在30-150纳米之间的微小膜泡，在绝大多数人体液，广泛存在于尿液、血液、乳汁、唾液等各种人体液。外泌体含有其宿主细胞中特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，在多种生理病理过程中起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，因此可作为液体活检的生物标志物。相比其他循环生物标志物，外泌体具有易于富集，稳定性强且不易降解的特点，受到越来越多关注。

由于肿瘤类型不同，肿瘤突变差异，细胞来源以及胞外环境的差异等，血液中的外泌体在尺寸分布，数量以及内容物组成等方面存在严重的个体差异。利用非对称流体技术手段，可按照粒径进一步将30-150nm的外泌体群体分为小于50nm，60-80nm以及90-120nm三个亚群。质谱分析可知，每个亚群有自己的特征标志物。这表明外泌体的尺寸与内容物之间存在特定的关系。由于癌症类型的不同，癌细胞分泌的外泌体携带癌症特异性标志物与粒径之间也有关联。目前基于外泌体群体分析的液体活检技术，例如热泳富集技术结合适配体荧光多参数检测，对于6种常见癌症的诊断只有较低的准确率。因此，发展与粒径和表面标志物相关的外泌体亚型分析方法对于癌症的准确诊断有着极为重要的意义。

目前能够实现外泌体分析的技术包括：通过电镜来分析外泌体的大小和形态，采用动态光散射(DLS)估算平均粒径，并通过Westernblot和ELISA等方法对蛋白分子标志物进行检测。整个分析过程不仅样品处理复杂、耗时长、消耗样品量多，同时缺乏外泌体个体间的差异信息，无法同时得到粒径与分子标志物信息。厦门大学颜晓梅教授课题组在NanoFCM技术方面做出了杰出的成果，实现了对40nm外泌体的高灵敏测量，但缺乏足够的分子信息，需要通过对外泌体样品进行荧光免疫标记来实现特异性检测，因此受到荧光通道数目、荧光分析发光效率、样品前处理、半定量检测等限制，在外泌体亚型分析方面有很大的局限性。而传统的SPR技术由于缺乏单颗粒成像分析能力，无法同时获得外泌体的粒径和分子标志物信息，更无法分析外泌体的亚型。通过非对称流体技术或者尺寸排阻色谱技术将外泌体群体按照粒径大小分群的方式受到严苛的技术手段限制，在临床极不适用。因此，急需发展一种与尺寸和表面标志物相关的，免分离的外泌体亚型分析技术。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的需按照粒径大小将外泌体进一步分离的难点，提供一种免分离的，单外泌体尺度上的外泌体亚型分析方法，具有高灵敏性，高特异性，操作简单的特点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，该方法包括以下步骤：

1)将PDMS通道与金片键合，得到芯片，形成稳定的样品流通池；

2)通过Au-S键自组装法，将多种核酸适配体结合到步骤1)所得芯片表面，并利用MCH和BSA阻断芯片表面剩余的活性位点，得到基于核酸适配体捕获的外泌体传感器芯片，构成微流控进样体系；

3)将待检测外泌体样品加入步骤2)所得微流控进样体系，采用表面等离子体共振成像平台无标记实时监测并记录外泌体与适配体特异性相互作用；