[发明专利]一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法

权利要求书

1.一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)将PDMS通道与金片键合，得到芯片，形成稳定的样品流通池；

2)通过Au-S键自组装法，将多种核酸适配体结合到步骤1)所得芯片表面，并利用MCH和BSA阻断芯片表面剩余的活性位点，得到基于核酸适配体捕获的外泌体传感器芯片，构成微流控进样体系；

3)将待检测外泌体样品加入步骤2)所得微流控进样体系，采用表面等离子体共振成像平台无标记实时监测并记录外泌体与适配体特异性相互作用；

4)基于图像分析的单颗粒计数及粒径统计进行分析，具体分析方法为：

4-1)基于Python平台，利用图像差分算法，识别单帧图片上的外泌体图像；

4-2)利用追踪算法，按照时间序列，追踪单个外泌体贴附解离过程，记录其在贴附过程中的最大亮度，作为粒径的特征数值；

4-3)将外泌体群体按照粒径大小分为三个亚群，分别统计每个亚群中的数量占比。

2.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，步骤1)中，PDMS通道通过以下方法获得：采用CAD绘制通道图案，将该图案印制在菲林板模具上，利用光刻技术，在菲林板模具的硅片表面形成图形化的微流控通道，清洗，依次进行高温处理和硅烷化处理，使硅片表面亲水；将PDMS液体倒入模具内，高温固化后，即可得到PDMS通道。

3.根据权利要求2所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，所述的PDMS通道尺寸：长×宽×高为10mm×1mm×30μm，每一个PDMS芯片含有三条通道；

所述的高温处理温度为120-150℃，时间为1-3小时；

所述的高温固化的固化温度为85℃，固化时间为2-3小时。

4.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，步骤1)中，PDMS通道与金片键合的方法包括以下步骤：

1-1)将Au芯片充分清洗，并用氮气吹干，置于洁净的培养皿中待用；

1-2)将PDMS通道与Au芯片同时照射氧Plasma，将二者结合，高温固化后即可得到含芯片的样品流通池。

5.根据权利要求4所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，步骤1-2)中照射氧Plasma的时间为50秒；PDMS与Au芯片键合的温度为120℃。

6.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，步骤2)具体为：

2-1)将核酸适配体，MCH及TCEP进行混合，配置成修饰液，加入所述样品流通池内，避光过夜修饰；

2-2)用BSA溶液替换适配体修饰液，并静置，使BSA占据Au芯片表面未修饰的结合位点，之后用PBS清洗，即得到Aptamer/MCH/BSA修饰的外泌体捕获传感芯片。

7.根据权利要求6所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，步骤2-1)中，核酸适配体根据检测疾病的类型选择，其中一端为巯基；核酸适配体，MCH与TCEP的摩尔比为1：1：5；所述避光过夜修饰的温度为20℃；

步骤2-2)中，BSA溶液的质量体积浓度为1％w/v，修饰完毕后，用PBS冲洗三次。

8.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，步骤3)所述的表面等离子体共振成像平台，采用的物镜是油镜，物镜的数值孔径范围为1.39～1.79；

采用的激光光源为p偏振光，光源波长范围为550～780nm；

采用CMOS相机的像素大小范围在30～200nm。

9.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，其特征在于，步骤4-3)中，用30，50，100，160nm的二氧化硅纳米颗粒作为标准品，绘制标准曲线，对外泌体的粒径进行测定。