[发明专利]一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用

说明书

本发明公开了一种有助于特异性扩增目的基因的组合物，包括特异性识别DNA‑RNA杂合双链的缀合物和与背景基因互补的、包含有RNA碱基的锁匙核酸片段。本发明所述组合物中锁匙核酸片段和背景基因结合形成DNA‑RNA杂合双链后被DNA‑RNA杂合双链特异性缀合物识别、结合形成稳定的双链核酸‑缀合物复合体，抑制背景基因的延伸和扩增，从而帮助目的基因的特异性扩增。本发明所述组合物可作为基因突变检测试剂用于基因检测或疾病诊断。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用。

背景技术

基因突变(gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变引起的基因结构的改变。通常基因突变是发生在性细胞的突变，而体细胞突变是一种稀有突变，因此存在于大量的野生型背景DNA序列中，相对地，突变序列含量很少。例如肿瘤患者组织和外周血样本中含有少量的肿瘤细胞DNA，细菌或病毒感染初期出现的耐药情况等。体细胞突变常与疾病发生相关，可以作为发病或感染的标志物、预后判断的标志物以及用药指导的标志物。

目前体细胞突变的检测方法大致分为两种，一种是以聚合酶链式反应(PCR)为基础的扩增方法；另一种是与下一代测序(NGS)相关的检测方法。DNA测序法检测结果较为直观可靠，但是对取材和技术要求比较高，更重要的是，灵敏度不高，只能对含量大于20％的突变基因进行检测。PCR技术的高敏感性使检测微量核酸成为可能。通常采用突变体富集的方式，主要目的是为了增加野生型与突变型之间，或不同等位基因位点之间的差异。例如，锁核酸技术，肽核酸技术，MGB探针法等。

锁核酸(LNA)它是一种特殊的双环状核苷酸类似物。锁核酸技术是用合成的寡核苷酸去识别细胞内的核苷酸靶体，从而提高人们对细胞进程的控制能力，也可以在序列的外端加上LNA碱基，产生LNA-DNA-LNA复合聚合体，利用纯LNA寡聚体对杂交的高亲和力，可以提高DNA诊断技术。

肽核酸，一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，一种新的核酸序列特异性试剂。与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

但是无论是锁核酸还是肽核酸，尚有许多问题有待于进一步研究。例如，位点的选择、可替换LNA的类型、如何提高进入靶细胞的效率并稳定发挥作用。最关键的，作为人工合成类似物，他们与自然发生的核酸结构存在差异，因此反应体系的设计需进行特殊考虑。同时，作为非自然发生的人工合成寡核苷酸类似物，存在残留物是否能够完全被自然降解，从而造成生物污染的风险。

MGB探针法优点是精确度高，假阳性率低，该方法的主要限制因素是，MGB等属于修饰基团，一般需要对其5’进行锁核酸修饰和3’磷酸基团的修饰，同样也改变核酸的特性，因此在设计及定型需要多次实验反复摸索才能确定，无法通过建立在普通DNA结构的物理化学经验公式进行理论设计，操作复杂、耗时长。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种简单高效地有助于微量目的基因检出的组合物及其应用。利用锁匙核酸片段和背景基因结合形成DNA-RNA杂合双链后被DNA-RNA杂合双链缀合物特异性识别并结合，形成稳定的双链核酸-缀合物复合体，抑制背景基因的延伸和扩增，从而帮助特异性扩增目的基因，进一步地，提高微量目的基因的检出灵敏度。

本文中所用的术语“分子锁”是指特异性识别DNA-RNA杂合双链的缀合物和与背景基因互补的且包含有RNA碱基的锁匙核酸片段的组合。

所述锁匙核酸片段是指能够与背景基因结合，并能够被核酸双链特异性缀合物识别、结合形成稳定锁匙结构双链核酸-缀合物复合体的包含RNA核苷酸或RNA寡核苷酸链的核酸片段。