[发明专利]一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法

说明书

本发明提供一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法，包括：选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因，计算这两个内参基因的Ct值之差Ctsubgt;0/subgt;，判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度；如果该Ctsubgt;0/subgt;达到了无法保证检测结果准确的阈值，则提示重新采样进行DNA提取；如果该Ctsubgt;0/subgt;在保证检测结果准确的阈值范围以内，则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ctsubgt;1/subgt;，进而判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况。根据本发明，排除了样本本身的质量问题，保证了CNV检测结果的准确性，而且操作方便快捷，既缩短了检测时间，又节省了测序带来的高昂成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法。

背景技术

CYP2D6担负着人类20％-30％药物的代谢任务。许多研究表明，CYP2D6酶活性与该基因的多态性存在非常高的关联性，活性受到诱导而改变的情况非常少。而CYP2D6拷贝数变异(CNV)与其活性密切相关。例如*5纯合突变为0拷贝，这种基因型的人CYP2D6酶活性极低，容易导致经CYP2D6代谢的药物蓄积，易发生不良反应。而携带CYP2D6 3拷贝(3CNV)及以上的人其酶活性又非常高，对经其代谢药物消除率很高，常规剂量的药物在这类人体内往往难以达到有效的血药浓度，从而表现出对药物的耐受。因此对CYP2D6拷贝数的准确检测对于判定CYP2D6的代谢活性型非常重要。

目前常见的用于检测CYP2D6 CNV的方法有荧光定量PCR法，一代测序法，二代测序法，还有长片段PCR电泳法，以及最近兴起的数字PCR方法。目前的荧光定量PCR法受限于判读阈值的界定等原因，部分情况下会出现同一人的样本，前后两次测定的CNV结果不一致情况。而一代测序和二代测序的方法对测序结果的拼接分析要求比较高，也不能保证最终拼接结果完全准确，同时测序方法程序繁琐，耗时和耗费都比较高。长片段PCR电泳法虽然准确性高，但是需要再PCR之后进行电泳检测，操作繁琐，费时。数字PCR方法与荧光定量PCR类似，虽然是绝对定量，但是也存在相同判读阈值的情况下，同一人的样本两次采样测定的CNV结果不一致情况，结果并不一定准确，并且耗费较高。

目前市场上还未出现针对CYP2D6拷贝数变异检测获得医疗器械注册证的生物产品，研发用试剂盒包括：Agena Veridose CYP2D6(MALD-TOF)、thermofish CYP2D6(荧光定量PCR)等产品。Agena产品同样存在实验步骤繁琐，环境要求高等劣势，而thermofish产品只采用一个内参基因进行校准，未考虑到样本质量(降解等原因导致判定不准)因素，可能存在不准确的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法，从而解决现有技术中针对人CYP2D6拷贝数变异检测的方法存在准确度不高、程序繁琐、费时费力的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种人CYP2D6拷贝数变异检测的方法，用于非疾病诊断目的，所述方法包括以下步骤：A：选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因，针对人CYP2D6基因以及选取的这两个内参基因的序列特点，分别设计出相应的引物和探针；B：获得抽提的待测样本基因组DNA；C：在一个反应体系中，将所述引物和探针混合，加入反应液中；D：进行实时定量荧光PCR检测；E：通过计算这两个内参基因的Ct值之差Ct₀，判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度；如果该Ct₀达到了无法保证检测结果准确的阈值，则提示重新采样进行DNA提取；如果该Ct₀在保证检测结果准确的阈值范围以内，则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct₁，通过该Ct₁判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况。