[发明专利]一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法

权利要求书

1.一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法，用于非疾病诊断目的，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A：选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因，针对人CYP2D6基因以及选取的这两个内参基因的序列特点，分别设计出相应的引物和探针；

B：获得抽提的待测样本基因组DNA；

C：在一个反应体系中，将所述引物和探针混合，加入反应液中；

D：进行实时定量荧光PCR检测；

E：通过计算这两个内参基因的Ct值之差Ct₀，判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度；如果该Ct₀达到了无法保证检测结果准确的阈值，则提示重新采样进行DNA提取；如果该Ct₀在保证检测结果准确的阈值范围以内，则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct₁，通过该Ct₁判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况；

当内参基因为RPPH基因和TERT基因时，步骤E包括：计算RPPH基因的 CT值减去TERT基因的 CT值所得差值为CT₀，若-1.5≤CT₀≤0，判定样本质量合格；若CT₀＞0，或＜-1.5，则样本质量不合格；样本合格后，计算CYP2D6基因的Ct值减去TERT基因的Ct值所得差值为CT₁，当CT₁-1时，判定为0 拷贝变异，-1≤CT₁0.5时，判定为1拷贝变异，0.5≤CT₁1.4时，判定为2拷贝变异；

步骤A中设计的引物和探针如下：

针对人CYP2D6基因的上游引物CYP2D6-F：5’-CACCAGGAAAGCAAAGACAC-3’；

针对人CYP2D6基因的下游引物CYP2D6-R：5’-TGCAGCACTTCAGCTTCT-3’；

针对内参基因人TERT基因片段的上游引物TERT-F：5’-AGGGTCCTCGCCTGTGTA-3’；

针对内参基因人TERT基因片段的下游引物TERT-R：5’-CCCAGATTCGCCATTGTTCA-3’；

针对内参基因人RPPH基因片段的上游引物RPPH-F：5’-CCGCCTCTGGCCCTAGT-3’；

针对内参基因人RPPH基因片段的下游引物RPPH-R：5’-GCCACGAGCTGAGTGCGT-3’；

识别人CYP2D6基因突变的探针CYP2D6-Probe：5’-FAM-TGGGCCGGGGCTGTCCAGTG-BHQ1-3’；

识别内参基因人TERT基因片段保守序列特异性的探针TERT-Probe：5’-CY5-CAGGGCACACCTTTGGTCACTCCA-BHQ3-3’；

识别内参基因人RPPH基因片段保守序列特异性的探针RPPH-Probe：5’-VIC-TGTCACTCCACTCCCATGTCCCTTGG-BHQ1-3’；

步骤C中使用的各引物的浓度为800~1000nM，各探针的浓度为200~300nM。

2.一种用于检测人CYP2D6基因拷贝数变异的方法，用于非疾病诊断目的，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A：选取待测样本已知基因组内拷贝数确定的、不存在拷贝数变异的两个DNA序列作为内参基因，针对人CYP2D6基因以及选取的这两个内参基因的序列特点，分别设计出相应的引物和探针；

B：获得抽提的待测样本基因组DNA；

C：在一个反应体系中，将所述引物和探针混合，加入反应液中；

D：进行实时定量荧光PCR检测；

E：通过计算这两个内参基因的Ct值之差Ct₀，判定样本的降解程度是否达到检测不准的程度；如果该Ct₀达到了无法保证检测结果准确的阈值，则提示重新采样进行DNA提取；如果该Ct₀在保证检测结果准确的阈值范围以内，则进行CYP2D6基因Ct值与其中一个内参基因Ct值的差值计算得到Ct₁，通过该Ct₁判断待测样本CYP2D6拷贝数变异情况；

当内参基因为β-globin基因和ALB基因时，计算β-globin基因的CT值减去ALB基因的CT值所得差值为CT₀，若0≤CT₀≤0.9，判定样本质量合格；若CT₀＞0.9，或＜0，则样本质量不合格；样本合格后，进行CYP2D6基因的Ct值减去β-globin基因的Ct值所得差值为CT₁，若CT₁-0.5时为判定为0 拷贝变异，-0.5≤CT₁1.0时，判定为1拷贝变异，1≤CT₁1.7时，判定为2拷贝变异；

步骤A中设计的引物和探针如下：

针对人CYP2D6基因的上游引物CYP2D6-F：5’-CACCAGGAAAGCAAAGACAC-3’；

针对人CYP2D6基因的下游引物CYP2D6-R：5’-TGCAGCACTTCAGCTTCT-3’；

针对内参基因人ALB基因片段的上游引物ALB-F：5’- GGAGAAGGTCACTACTTGAAGAGATT-3’；

针对内参基因人ALB基因片段的下游引物ALB-R：5’-CATGAGAGATTAGGATTCTAGTATTTGC-3’；

针对内参基因人β-globin基因片段的上游引物β-globin-F：5’-GTGGATGAAGTTGGTGGTGAG-3’；

针对内参基因人β-globin基因片段的下游引物β-globin-R：5’-TAACAGCATCAGGAGTGGACAG-3’；

识别人CYP2D6因突变的探针CYP2D6-Probe：5’-FAM-TGGGCCGGGGCTGTCCAGTG-BHQ1-3’；

识别内参基因人ALB基因片段保守序列特异性的探针ALB-Probe：5’-VIC-CTATATTCCTTCCCTTAATTAACTCTGTTT-MGB-3’；

识别内参基因人β-globin基因片段保守序列特异性的探针β-globin-Probe：5’-CY5-AAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAG-BHQ1-3’；

步骤C中使用的各引物的浓度为800~1000nM，各探针的浓度为200~300nM。