[发明专利]一种表达人GM-CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用

说明书

本发明涉及生物病毒构建领域，具体公开了一种表达人GM‑CSF的重组溶瘤新城疫病毒，通过在新城疫病毒Italien株全长基因组质粒中插入人GM‑CSF编码基因，经过病毒体外复活获得，所述的人GM‑CSF基因如SEQ ID NO.1所示。本发明利用GM‑CSF分子招募单核细胞来源的DC细胞、激活中性粒细胞、促进DC细胞分化成熟特别是促进抗原加工和呈递方面具有的重要作用，结合溶瘤新城疫病毒肿瘤选择性复制的特性，在直接杀伤肿瘤细胞、引起的炎症反应的同时，招募更多DC细胞并促进其成熟和呈递肿瘤抗原，增强肿瘤局部和全身的抗肿瘤免疫应答反应，提高单独或者联合应用溶瘤病毒治疗实体肿瘤的治疗效果，为肿瘤免疫治疗带来新的治疗思路。

技术领域

本发明属于生物病毒构建领域，具体涉及一种表达人GM-CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用。

背景技术

溶瘤病毒(oncolytic virus)是指一类能够特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，利用溶瘤病毒对肿瘤进行治疗是肿瘤生物治疗的研究热点之一。溶瘤病毒主要通过2种机制实现对肿瘤的杀伤，一是病毒感染后引起宿主细胞的功能紊乱或者病毒大量复制导致的宿主细胞直接死亡。二是溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，通过增强肿瘤抗原呈递、引起肿瘤细胞免疫源性死亡、释放多种细胞因子及趋化因子等多种机制增强局部乃至全身的抗肿瘤免疫反应，产生更加持久和广泛的抗肿瘤效果。随着近年来肿瘤免疫治疗的兴起，后一种机制被认为更加重要，特别是联合其它的抗肿瘤免疫治疗策略如CART细胞治疗，可以大大增强对实体肿瘤的治疗效果。

另一方面，溶瘤病毒通过改造，自身可以作为复制性病毒载体，携带外源效应基因在肿瘤局部特异性的高表达，也可以进一步增强溶瘤病毒的治疗效果。目前溶瘤病毒携带的外源分子主要包括以下几类：诱导细胞死亡相关分子，抗血管生成分子，免疫调节因子等。免疫调节因子是目前最主要的外源效应分子，如GM-CSF，CCL5等。如已经被FDA批准上市的T-VEC即是利用重组HSV溶瘤病毒表达免疫调节细胞因子GM-CSF，增强溶瘤病毒的效果。

新城疫病毒(NDV)是一种天然的溶瘤病毒，为单股负链RNA病毒，其天然宿主为禽类，对人体无致病性。NDV用于肿瘤治疗的研究历史超过50年，研究结果表明NDV应用于人体具有良好的安全性，在体内体外均可以选择性的杀伤多种人肿瘤细胞，实现一定的治疗效果，但是单纯依靠天然NDV的溶瘤作用还不足以产生足够的治疗效果，因此还需要对其进行改造，通过携带表达不同的效应基因以及开展与其它治疗方法的联合应用提高疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达人GM-CSF的重组溶瘤新城疫病毒及其应用，解决了解决目前肿瘤治疗，特别是实体肿瘤免疫治疗中，肿瘤免疫抑制性微环境导致免疫治疗效果不佳的问题。

本发明提供了一种表达人GM-CSF的重组溶瘤新城疫病毒，通过将人GM-CSF基因插入新城疫病毒Italien株基因组质粒中，经体外病毒复活获得，所述的人GM-CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述表达人GM-CSF的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，具体包括如下步骤：

S1，在CDS区上下游分别添加NDV转录调控序列GS和GE，在片段两端添加BsiWI酶切位点，然后经BsiWI酶切连接至基因组质粒pBR-rNDV位点，获得质粒pBR-rNDV-hGMCSF，转入工程菌中；

所述GS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述GE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

S2，BSR-T7/5经消化后转移至新的容器中，加入DMEM培养基培养，采用PEI转染试剂进行转染，转染完成后观察细胞生长状态，待出现细胞融合现象后表明病毒复活成功，重组病毒命名为rNDV-hGMCSF。

进一步地，S2中，所述DMEM培养基含体积分数10％胎牛血清和100μg/mL青链霉素。