[发明专利]一种通过串联质谱法测定特异性有机酸的方法

说明书

本发明提供一种通过串联质谱法测定特异性有机酸的方法，该方法采用串联质谱法(MS/MS)分析尿液中的14种特异性有机酸。本发明方法前处理简单、分析速度快、灵敏度较高，能够对甲基丙二酸尿症和丙酸尿症进行区分，适用于大批量的样本分析，可作为筛查8种有机酸尿症的最佳方法。

技术领域

本发明属于测定方法，涉及一种通过串联质谱法测定特异性有机酸的方法。

背景技术

有机酸尿症(Organic aciduria)是最常见的遗传代谢病类型之一。正常情况下氨基酸、糖、脂肪酸等分解代谢过程中产生的羧基酸在体内迅速转化，在体液内含量极低，但由于某些代谢路径中的酶或辅酶的缺陷会导致羧基酸代谢发生障碍，大量有机酸在体内异常蓄积，血液中有机酸浓度增高，并从尿液中大量排出，导致有机酸尿症。目前已发现的有机酸尿症均属于常染色体隐形遗传，常见的有机酸尿症包括甲基丙二酸血症、异戊酸血症、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、丙酸血症、3-羟基-3-甲基戊二酸尿症等。

在缺乏治疗的情况下，症状会恶化，并可能继续昏迷甚至死亡。快速而又准确的诊断可以预防包括身体、智力发育迟缓在内的慢性后遗症，有效地控制疾病造成的影响，这也对筛查的效率及准确性提出了更高的要求。8种有机酸尿症及其特异性标志物的对应关系如表1所示，14种标志物的结构式及分子量如下所示。

表1 8种有机酸尿症及其特异性标志物

目前，大部分疾病筛查中心使用血斑-串联质谱法(MS/MS)和尿-气相色谱质谱法(GC-MS)对新生儿有机酸尿症进行筛查。在血液中，有机酸与游离肉碱结合后以酰基肉碱的形式存在，串联质谱法需要采集新生儿足底血制成血斑，对血斑中的氨基酸、游离肉碱、酰基肉碱等进行分析。但该方法在临床应用上仍存在一定的问题：第一，无法区分甲基丙二酸血症和丙酸血症；第二，部分疾病未能使用最具特异性的标志物进行筛查，如3-羟基-3-甲基戊二酸尿症的特异性标志物为3-甲基戊二酸、3-甲基戊烯二酸和3-羟基-3-甲基戊二酸，但在血斑-联质谱法中仅使用3-羟基异戊酰基肉碱(C5OH)和己二酰基肉碱(C6DC)作为疾病判断依据。这些都可能会导致新生儿筛查的假阳性率的偏高，并且血斑的采集属于损伤性采样，会增加新生儿感染的风险。在尿液中，有机酸以酸或盐的形式存在，在进行气相色谱质谱联用法(GC-MS)分析前需要对尿液中的有机酸进行衍生化处理，该方法前处理时间长，仪器分析时间也较长，并不适用于大批量的样本分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过串联质谱法测定特异性有机酸的方法，所述有机酸为：甲基丙二酸(MM)、3-羟基丙酸(3-HP)、甲基枸橼酸(MC)、N-巴豆酰甘氨酸(NTG)、3-羟基异戊酸(3-HIV)、3-甲基巴豆酰甘氨酸(3-MCG)、异戊酰甘氨酸(IVG)、丙酰甘氨酸(PG)、戊二酸(GA)、3-羟基戊二酸(3-HG)、2-甲基-3-羟基丁酸(2-MHB)、3-甲基戊二酸(3-MG)、3-甲基戊烯二酸(3-MGC)、3-羟基-3-甲基戊二酸(3-HMG)。

本发明通过以下技术方案实现：

(1)溶液及样本溶液的制备

对照品溶液：选取甲基丙二酸(MM)、3-羟基丙酸(3-HP)、甲基枸橼酸(MC)、N-巴豆酰甘氨酸(NTG)、3-羟基异戊酸(3-HIV)、3-甲基巴豆酰甘氨酸(3-MCG)、异戊酰甘氨酸(IVG)、丙酰甘氨酸(PG)、戊二酸(GA)、3-羟基戊二酸(3-HG)、2-甲基-3-羟基丁酸(2-MHB)、3-甲基戊二酸(3-MG)、3-甲基戊烯二酸(3-MGC)、3-羟基-3-甲基戊二酸(3-HMG)作为对照品，精密称定，分别用甲醇水溶液(1:1，体积比)为溶剂配制成对照品储备溶液(用于标准曲线的建立及加标回收率实验)。各对照品溶液中，对照品的浓度为1000mg/L。