[发明专利]基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1scFv的CAR‑T细胞的制备方法。本发明所述的制备方法包括：睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒的构建；睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒的制备；电转制备CAR‑T细胞；扩增富集CAR‑T细胞；以及CAR‑T细胞收获和鉴定。本发明通过非病毒方法得到分泌PD1scFv且靶向CD133的CAR‑T细胞，该细胞不仅能有效地将CAR‑T细胞和免疫检查点抑制剂的优势联合起来，且采用的非病毒睡美人转座子联合微环的方法，还能进一步去除质粒上的抗性基因，能最大程度保证CAR‑T细胞在临床应用的安全性。

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1单链抗体scFv的CAR-T细胞的制备方法，具体涉及一种基于睡美人转座子和微环载体技术构建非病毒CAR-T细胞的方法。

背景技术

原发性肝癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，传统的手术、放化疗仍难有效治疗肿瘤，迫切需要开发新的治疗手段，免疫治疗已成为当前肿瘤治疗研究和临床应用的热点。其中，通过基因工程手段在体外修饰T细胞后再回输至患者体内的CAR-T细胞疗法，在治疗血液系统恶性肿瘤中展现出巨大的优势，但其在实体瘤中的治疗效果不佳，因此有必要研究如何改进CAR-T细胞的功能，使之能在实体瘤中得到更好的应用。

CD133是一种跨膜糖蛋白，有研究报道，CD133在中晚期肝癌中表达，除此之外，CD133还是肿瘤干细胞和内皮祖细胞的标志，常常伴随着肿瘤的转移和复发，这些特征使CD133成为CAR-T细胞合理的靶点。免疫检查点抑制剂如PD1单抗，能通过解除T细胞表面PD1抑制性受体的信号，恢复T细胞对肿瘤的杀伤能力，在多种实体瘤中延长患者的生存时间。因此，CAR-T细胞和免疫抑制点疗法给攻克肿瘤带来了很多希望，而构建一种能分泌PD1scFv且靶向肿瘤的CAR-T细胞能有效将这两种技术有机结合在一起，有望为治疗实体瘤提供一种新的策略。然而，在制备能分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的过程中仍有很多亟需解决的问题，如目前大多数CAR-T细胞是基于慢病毒或逆转录病毒载体构建的，基于病毒的方法能保证CAR-T细胞的高转染效率，但是病毒载体的制备过程复杂，成本昂贵。此外，病毒载体潜在地能引起插入突变、致瘤性，并且在载体效力、安全性评估以及运输上都存在挑战。

免疫检查点抑制剂如PD1抗体在临床上也取得了很好的疗效，但其价格昂贵，且患者需要多次回输，PD1抗体常通过静脉给药，难以精准靶向肿瘤。同时，PD1抗体在体内非肿瘤组织的富集也会降低PD-1抗体的作用并引起一定的副作用。因此，研发一种快速、安全的非病毒基因递送系统，并通过该方法构建出能分泌PD1 scFv的CAR-T细胞有望同时发挥细胞治疗和免疫抑制点治疗的优点，为中晚期肝癌的治疗提供一种新策略具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1scFv的CAR-T细胞的制备方法，该方法能解决目前用病毒制备CAR-T细胞和质粒修饰T细胞常带有抗性基因等安全性不足的问题，通过联合睡美人转座子和微环载体技术实现CAR基因对T细胞的稳定整合，同时也避免了质粒抗性基因在人体应用中的潜在风险。

本发明所述的基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法，是通过非病毒方法构建一种能自分泌PD1 scFv且靶向CD133的CAR-T细胞，包括以下步骤：

A.睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒的构建：合成构建靶向CD133且能分泌PD1-scFv的CAR序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过同源重组的方法构建入微环母体质粒中，即为睡美人CAR微环母体质粒；合成构建睡美人转座酶序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过酶切方式构建入微环母体质粒中，即为睡美人转座酶微环母体质粒。