[发明专利]基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法

权利要求书

1.一种基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒的构建：合成构建靶向CD133且能分泌PD1-scFv的CAR序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过同源重组的方法构建入微环母体质粒中，即为睡美人CAR微环母体质粒；合成构建睡美人转座酶序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过酶切方式构建入微环母体质粒中，即为睡美人转座酶微环母体质粒；

B.睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒的制备：将步骤A所构建的睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒在42℃通过热激的方法转入感受态细胞中，随后加入200μl SOC培养基，置于摇床上37℃、250rpm摇60min，随后将菌液涂于含卡那抗性的培养板上，37℃过夜培养；第二天，挑单克隆至含卡那抗性的400ml LB培养基中，30℃、250rpm摇4～6小时，随后转至400ml TB培养基中，37℃、250rpm过夜培养，但不超过16小时；第三天加入等体积的LB培养基，进行阿拉伯糖诱导培养，在32℃、250rpm置于摇床上再摇5h,离心收菌液沉淀，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，测浓度，得到睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒；

C.电转制备CAR-T细胞：用磁珠分选PBMC中的T细胞，计算细胞的密度，取1×10⁷个T细胞，离心去除上清，DPBS洗2遍，100μl电转液重悬细胞，并将制备好的睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒按1:1的比例加入电转液进行电转，电转取出后放入预包被CD133抗原和CD28抗体的6孔板中，放入37℃培养箱中培养，电转后的培养基采用T细胞无血清培养基；培养3-5天后，根据细胞状态更换培养液并转至T25培养瓶中培养，在第7-10天(根据细胞扩增数量)检测CAR-T阳性率、存活率，并转移至T75培养瓶中扩增培养；

D.扩增富集CAR-T细胞：继续在T75培养瓶中将所述CAR-T细胞培养至第14天或第15天，检测CAR-T细胞的阳性率，若CAR-T细胞阳性率＞50％，则不进行富集；若CAR-T细胞阳性率＜50％，且细胞数超过1×10⁷个，则通过加入myctag-生物素抗体对细胞进行富集，并通过磁珠分选得到CAR-T细胞，分选得到后的CAR-T细胞放置在6孔板中继续培养；

E.CAR-T细胞收获和鉴定：培养扩增富集后的CAR-T细胞，收集CAR-T细胞，通过流式细胞术检测CAR-T的阳性率，qPCR和WB共同鉴定，收集细胞上清检测PD1 scFv的分泌情况；杀伤实验鉴定细胞的靶向杀伤功能。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤B中，所述阿拉伯糖诱导培养是在800ml LB培养基中加入16ml 1mol/L NaOH和0.4ml 20％L-阿拉伯糖进行培养。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤C中，电转后的T细胞无血清培养基为X-Vivo培养基，并添加IL-2、IL-7、IL-15和2％FBS进行培养。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤C中，所述扩增培养包括：扩增激活使用CD3/CD28刺激剂，每毫升培养物加入25μl刺激剂；培养T细胞所用培养基为X-Vivo培养基，每毫升培养物加入IL-2 1000IU。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤D中，所述富集的抗体采用myctag-生物素(CST)，二抗采用抗生物素磁珠，过磁珠分离柱，留在柱子上的即为富集的CAR-T细胞，加入5ml洗脱缓冲液于分离柱上，将其从磁力架上取下，用配套的活塞推动柱子，从柱子上下来的即为CAR-T细胞，DPBS洗涤一遍后放于6孔板培养扩增。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：所述步骤D中，每1×10⁷个细胞加入myctag-生物素抗体10μl和抗生物素磁珠20μl。