[发明专利]一种多糖的检测方法

权利要求书

1.一种多糖的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将植物酵素样品依次经过淀粉酶酶解、蛋白酶酶解、核酸酶酶解和醇沉后得到多糖提取液；

(2)配制系列标准品溶液，进行高效体积排阻色谱分析，构建相对分子质量校正曲线，并根据各标准品溶液的浓度及其峰面积计算得到标准品溶液的峰面积响应因子；

(3)将步骤(1)的多糖提取液采用高效体积排阻色谱进行检测，根据所述多糖提取液的特征峰面积和步骤(2)得到的标准品溶液的峰面积响应因子计算所述植物酵素样品中多糖的含量。

2.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，多糖提取液的特征峰面积为相对分子质量为3000以上所有峰的总面积。

3.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，系列标准品溶液为至少6个不同相对分子质量大小的右旋糖酐标准品溶液，所述右旋糖酐标准品溶液的浓度为5mg/mL；所述右旋糖酐标准品的相对分子质量选自2700-2000000。

4.如权利要求3所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述右旋糖酐标准品包括相对分子质量为2700的右旋糖酐标准品和至少一个相对分子质量大于所述步骤(1)中多糖提取液的相对分子质量分布范围上限的右旋糖酐标准品。

5.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，标准品溶液的峰面积响应因子为所有标准品溶液的单位浓度峰面积平均值或与步骤(1)的多糖提取液中峰面积最大的级分的峰值相对分子质量最相近的标准品溶液的单位浓度峰面积。

6.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对标准品溶液进行高效体积排阻色谱进样分析，根据系列标准品溶液的相对分子质量的对数和保留时间，构建相对分子质量校正曲线。

7.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述高效体积排阻色谱的色谱条件为：流速：0.7-1.0mL/min；柱温：30-45℃；进样量：10-20μL；流动相：浓度为0.10mol/L的硝酸钠溶液或浓度为0.10mol/L的醋酸钠溶液。

8.如权利要求1所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：

S1：称取9-11克的液体植物酵素样品或2.0-3.0克的固体饮料剂型的植物酵素样品，用浓度为0.01-0.02mol/L的pH＝5.5-6.0磷酸盐缓冲液溶解定容至25mL，然后加入10-20μL复合淀粉糖化酶，于60℃振荡酶解反应2-4小时后，置入95℃杀酶3-5min，冷却至58℃，然后用2mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.0-8.5，得到溶液A；

S2：将溶液A中加入10-15mg碱性蛋白酶于58℃下振荡反应2-3小时后，置入95℃下杀酶3-5min，冷却至室温后，离心取上清液，然后加水定容后为溶液B；

S3：取5mL溶液B与25μL全能核酸酶稀释液混合，在37℃下反应15min后，于95℃下杀酶3-5min，冷却至室温后，离心取上清液为溶液C；

S4：将4倍溶液C体积的无水乙醇和溶液C混合，在4℃下静置8-12h后，离心取沉淀物加水溶解并定容至1mL，得到多糖提取液；或将溶液C经过3KD超滤离心管离心得到的截留物，用水溶解并定容至1mL后得到多糖提取液。

9.如权利要求8所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述S1中，复合淀粉酶为糖化酶和普鲁兰酶的混合物，糖化酶的酶活性≥10万u/mL，普鲁兰酶的的酶活性1000u/mL；所述S2中，碱性蛋白酶的酶活力≥20万U/g。

10.如权利要求8所述的多糖的检测方法，其特征在于，所述S3中，全能核酸酶稀释液为1μL全能核酸酶试剂与pH＝8.0的稀释缓冲液的混合溶液，全能核酸酶试剂与稀释缓冲液的体积比为1:199；全能核酸酶试剂的酶活性≥250U/μL；稀释缓冲液为Tris-HCl，MgCl₂和NaCl的混合溶液，其中Tris-HCl的浓度为20mmol/L，MgCl₂和NaCl的浓度均为2mmol/L。