[发明专利]用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用。该融合蛋白包含a)Cas9酶域；b)不稳定结构域(DD)；c)胞嘧啶脱氨酶域(CDA)以及d)尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)域。其能够在各种真核生物的基因组中实现高效率、高精度、可调控的碱基编辑。并能够在不引入缺失和插入的情况下，在各种真核生物的基因组中实施高精度高功效的C‑T碱基编辑。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas系统以其方便、高效的优势成为近些年来应用最广的基因编辑工具。在sgRNA的引导下，Cas蛋白到达靶位点处切割产生双链断裂，联合后续的DNA修复过程，借助于非同源末端连接实现基因敲除，或给予一段DNA模板，借助于同源重组实现基因修复。

然而同源重组介导的基因修复效率普遍不高，且会引入大量的插入与缺失。将胞嘧啶脱氨酶与Cas蛋白融合而成的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)可以在不产生双链断裂的情况下在内源基因组上引入高效率的C到T(G到A)的突变，是进行基因突变纠正的有效工具，也成为基因治疗研究的热门选择。然而最常用的治疗用载体腺相关病毒AAV会造成其携带的碱基编辑器在体内的长期表达，理论上会增加全基因组内随机脱靶的风险。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明将Destablizing Domain(DD)与CBE融合表达构建了调控型的CBE，在不加外源小分子药物情况下，CBE表达产物被立即降解，理论上不引起编辑和脱靶；加入外源小分子药物，可以控制CBE表达时间，引起靶位点处有效碱基编辑的同时，理论上可以大大降低随机脱靶效应，提高临床治疗的安全性。

具体的：

本发明的第一方面涉及融合蛋白，其包含a)Cas酶域；b)不稳定结构域(DD)；c)胞嘧啶脱氨酶域(CDA)以及d)尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)域。

本发明的第二方面涉及一种组合物，其包含如上所述融合蛋白、与所述Cas酶域结合的引导RNA以及trimethoprim。

本发明的第三方面涉及宿主细胞，其含有如上所述的组合物，并且其基因组中含有所述引导RNA所识别的靶序列。

本发明的第三方面涉及分离的核酸，其表达如上所述融合蛋白。

本发明的第四方面涉及载体，其含有如上所述的核酸，以及任选的引导RNA。

本发明的第五方面涉及改变基因产物表达的方法，其包括：

将如上所述的核酸，或如上所述载体导入宿主细胞并在trimethoprim存在的条件下表达出所述融合蛋白并与引导RNA配合以改变基因产物的表达。

本发明的第六方面涉及递送系统，其包括i)如上所述融合蛋白、或如上所述的核酸，或如上所述载体；ii)引导RNA以及iii)递送媒介物。

本发明的第七方面涉及药物组合物，其包含如上所述的递送系统以及药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所提供的融合表达Destablizing Domain与CBE的方法，可以在各种真核生物的基因组中实现高效率、高精度、可调控的碱基编辑。能够在不引入缺失和插入的情况下，在各种真核生物的基因组中实施高精度高功效的C-T碱基编辑。

本发明理论上可用于在体基因治疗，为CBE更加安全的应用于临床提供了新的方法和思路。

附图说明