[发明专利]可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株、表达菌株的构建方法及产物的诱导表达方法

说明书

本发明公开了一种可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）bIFNT成熟肽基因的扩增与获取；（2）bIFNT成熟肽基因克隆质粒的构建；（3）可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株的构建；其中，所述可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株的bIFNT成熟肽的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。同时，本发明还公开了可溶性bIFNT成熟肽表达菌株的构建方法及产物的诱导表达和纯化方法。本发明提供的方法成功构建了与天然bIFNT成熟肽基因序列完全一致的可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株和可溶性bIFNT成熟肽表达菌株，应用大肠杆菌原核表达体系，可实现低成本大规模制备rbIFNT。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及一种可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株、表达菌株的构建方法及产物的诱导表达和纯化方法。

背景技术

牛干扰素-τ(bIFNT)最初被命名为牛滋养层蛋白1，是一种由早期胚胎滋养层细胞分泌的Ⅰ型干扰素，其主要功能是在母体妊娠识别过程中发挥关键信号因子作用，通过抑制子宫内膜中黄体溶解相关机制的发生，刺激一系列干扰素刺激基因(ISGs)表达增加子宫内膜容受性，从而实现妊娠的建立。bIFNT在受精后第15天-17天分泌量达到峰值，28天后分泌量快速下降，通过体外补充bIFNT对于提升牛子宫内膜容受性和增加妊娠率具有重要意义。此外，bIFNT还能够发挥低细胞毒性的抗病毒和免疫调节功能等。因此，bIFNT在提高牛妊娠率、生殖系统疾病治疗以及科学研究等领域均具有广阔的应用价值和开发前景。

重组蛋白表达技术能够高效大量获得目的蛋白，其中大肠杆菌原核表达系统具有稳定、便捷和成本低的优点，适合大规模制备生产；但表达蛋白常以不可溶的包涵体形式存在，生物活性低，且在变性和复性过程中易发生损失，因此常需要通过优化表达条件，增加可溶性产物的表达量，以获得与应用真核表达系统制备的生物活性相当的目的蛋白。

在现有技术中：张明在大肠杆菌中表达了bIFNT成熟蛋白CDS区(张明，四川农业大学博士论文，2007)；刘宝山等在大肠杆菌中克隆了黄牛干扰素-τ的基因(刘宝山等，兽医科技，2009)；张灿在大肠杆菌中克隆表达了荷斯坦奶牛干扰素-τ(张灿，动物医学进展，2014)；李明振在大肠杆菌中原核表达了重组牛rIFNT(李明振，南京农业大学硕士论文，2016)。

但上述技术存在以下几点关键问题：克隆产物的基因序列与GeneBank中登录的bIFNT基因序列不完全一致，导致重组蛋白中较多氨基酸与天然bIFNT蛋白不同，生物学功能发生变化，甚至造成蛋白质翻译提前终止，无法完整表达蛋白；所表达蛋白产物大多以包涵体形式存在，生物活性低，且需要变性与复性处理，增加了工艺步骤、纯化时间和蛋白损失；诱导表达和纯化工艺复杂，不适合大范围推广生产。此外，目前国内市面上还尚未见商品化rbIFNT产品。因此寻求一种基因序列准确、表达稳定、生物活性强、工艺简便、成本低廉、适于推广和大规模生产的可溶性原核表达制备方法成为rbIFNT产品研发的重点。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株、表达菌株的构建方法及产物的诱导表达和纯化方法，本发明提供的方法构建的可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株和可溶性bIFNT成熟肽表达菌株与天然bIFNT成熟肽基因序列完全一致。

一种可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)bIFNT成熟肽基因的扩增与获取

(11)设计PCR扩增引物：

在Forward端和Reverse端分别添加NDEⅠ和BamHⅠ酶切位点，扩增引物如下：

Forward端：5’-CAT ATG TGT TAC CTG TCT GAG GAC CAC ATG-3’，其中划线部位为引入的NDE Ⅰ酶切位点；