[发明专利]可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株、表达菌株的构建方法及产物的诱导表达方法

权利要求书

1.可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）bIFNT成熟肽基因的扩增与获取

（11）设计PCR扩增引物：

在Forward端和Reverse端分别添加NDE Ⅰ和BamHⅠ酶切位点，扩增引物如下：

Forward端：5’-CAT ATG TGT TAC CTG TCT GAG GAC CAC ATG-3’；

Reverse端：5’-GGA TCC TCA AAG TGA GTT CAG ATC TCC ACC-3’；

（12）获取bIFNT成熟肽基因模板：

采集奶牛尾静脉血，提取奶牛全基因组DNA；

（13）PCR扩增；

（14）PCR扩增产物凝胶电泳与回收：

将PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将目的条带从琼脂糖凝胶上切下，回收DNA，回收后的DNA即为bIFNT成熟肽基因；

（2）bIFNT成熟肽基因克隆质粒的构建

（21）bIFNT成熟肽基因连接碱基“A”：

bIFNT成熟肽基因连接碱基“A”，回收反应产物；

（22）连接载体pMD19-T：

将步骤（21）得到的连接碱基“A”后的bIFNT成熟肽基因与载体pMD19-T连接，得到pMD19-bIFNT-T质粒；

（3）可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株的构建

（31）转化：

将构建的pMD19-bIFNT-T质粒转化入E. coli工程菌DH5α感受态细胞中，其方法为：将10μL构建完成的质粒和10μL的DH5α感受态细胞混合，置于冰上30min，42℃热激1min，放入冰上3-5min；

（32）筛选DH5α阳性单克隆菌株：

向步骤（31）的产物中加入500μL无抗性LB液体培养基，于37℃摇床中转速180-200rpm摇菌1h，4000rpm离心5min，吸弃上清，保留50-100μL液体重悬沉淀，将重悬后的菌液涂布于含50μg/mL Amp的LB平板上，37℃培养过夜；

（33）挑取DH5α阳性单克隆菌株：

挑取LB平板上生长的形态大小各不相同的DH5α阳性单克隆白色菌落，加入至1mL含50μg/mL Amp的LB 液体培养基中，于37℃摇床中转速180-200rpm摇菌至菌液浑浊；

（34）DH5α阳性单克隆菌株的鉴定：

对DH5α阳性单克隆菌株菌液进行PCR初步鉴定；将经菌液PCR初步鉴定正确的DH5α阳性单克隆菌株菌液使用pMD19-T载体的通用引物测序，所测基因序列与GeneBank中登录的bIFNT mRNA CDS区成熟肽基因序列完全一致的DH5α阳性单克隆菌株即为可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株；其中，所述可溶性bIFNT成熟肽基因克隆菌株的bIFNT成熟肽的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤（13）中PCR扩增如下：

PCR反应体系为：奶牛全基因组DNA 1.5μL、Primer Star高保真酶0.25μL、dTNP Mix 2μL、5×PS Buffer 5μL、Forward引物0.5μL、Reverse引物0.5μL、RNase Free水补至25μL；

PCR反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次，72℃最终延伸10min；

步骤（21）中bIFNT成熟肽基因连接碱基“A”的反应体系和反应条件如下： 2×Taq PCRStarMix 12.5μL、bIFNT成熟肽基因12.5μL，72℃延伸30min，回收反应产物；

步骤（22）中连接碱基“A”后的bIFNT成熟肽基因与载体pMD19-T连接的反应体系和反应条件如下：载体pMD19-T1μL、连接碱基“A”后的bIFNT成熟肽基因4μL、Solution Ⅰ 5μL，16℃，连接2-12h；

步骤（34）中进行PCR初步鉴定的反应体系和反应条件如下：

反应体系：DH5α阳性单克隆菌株的菌液 1μL、2×Taq PCR StarMix 7.5μL、Forward引物0.3μL、Reverse引物 0.3μL、RNase Free水补至15μL；

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃最终延伸5min。