[发明专利]一种抗菌脂肽类化合物的制备方法

说明书

本发明公开了一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，解决了枯草芽孢杆菌现有发酵培养基产量低、生产成本高、抗菌脂肽类化合物提取困难等问题。本发明选用的发酵培养基在氮源选择方面采用价格低廉、添加方便的牛骨蛋白胨代替原有昂贵、黏稠的牛肉膏，有效的降低了抗菌脂肽类化合物发酵生产成本，同时加入了锰、镁等金属离子，更有利于促进枯草芽孢杆菌产孢及合成产物，显著提高了抗菌脂肽类化合物的产量以及抗菌活性的能力。

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，特别是一种抗菌脂肽类化合物的制备方法。

背景技术

近年来，随着现代化和工厂化畜禽和水产养殖的迅速发展，为抑制病害而引发的抗生素滥用现象屡禁不绝。在饲料或养殖水体中添加益生菌或者益生菌发酵代谢产生的活性物质，进而代替抗生素已成为健康养殖新的研究方向。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，能够产生耐热、抗逆的芽孢，可以在恶劣的环境中生存。抗菌脂肽类化合物是枯草芽孢杆菌通过非核糖体途径合成的小分子抗菌脂肽类化合物，具有抑菌性广、耐药性低和热稳定性高等优点。在食品领域，抗菌脂肽类化合物能作为防腐剂来改善食品的性状；在农业领域，它能够抑制植物致病菌，生防效果良好；在医药领域可用于脂肽类疫苗，用来控制细菌病原菌；在畜牧业领域常用于饲料添加剂，促进畜禽生长。此外，抗菌脂肽类化合物也是目前唯一从微生物中得到并对黄曲霉具有显著抑制作用的活性物质。

但是在现有的技术中，由枯草芽孢杆菌发酵培养基生产抗菌脂肽类化合物的活性水平比较低，且价格昂贵，这严重制约了抗菌脂肽类化合物的大规模工业化生产。因此，寻找一种可以提高产量、降低生产成本的发酵培养基和一种制备抗菌脂肽类化合物的方法是当下迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中抗菌脂肽类化合物产量低，生产成本高的问题，提供一种抗菌脂肽类化合物的制备方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取枯草芽孢杆菌菌株，接种于斜面LB培养基上，于30℃培养24h，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，于30℃摇瓶培养16-18h，得到枯草芽孢杆菌活化液，所述枯草芽孢杆菌活化液的OD₆₀₀为0.8-1.0；

步骤二、将枯草芽孢杆菌活化液接种于发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌活化液的接种量为4-8％，于28-32℃，150-210r/min旋转条件下发酵培养36-60h，得到发酵液；

步骤三、将所述发酵液离心，得到发酵上清液；

步骤四、调节所述发酵上清液的pH＝2，静置2-8h，离心收集沉淀；再用甲醇反复抽提，使用旋转蒸发仪干燥其抽提液，得到抗菌脂肽类化合物脂肽提取物。

优选地，所述步骤一中，所述LB培养基由如下质量百分比的组分组成：胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％，所述LB培养基的pH值为7.2-7.4。

优选地，所述步骤二中，发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：糖0.5％-2.5％、蛋白胨0.5％-3％、金属离子化合物以金属离子计0.01％-1％，所述金属离子为锌离子、钾离子、镁离子、锰离子中的一种或多种，所述糖为葡萄糖、蔗糖、甘油中的一种或多种，所述蛋白胨为胰蛋白胨、牛骨蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或多种，所述发酵培养基的pH值为6.0-8.0。

优选地，所述步骤三中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为10-20min。

优选地，所述步骤四中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为5-15min。

优选地，所述步骤四中，使用4-8mol/L的HCl溶液调节发酵上清液的pH值。