[发明专利]一种家蚕抗菌肽BMGlvA2重组蛋白制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种家蚕抗菌肽BMGlvA2重组蛋白制备方法及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明涉及基因工程领域，将工程菌株里氏木霉作为表达宿主，实现该家蚕抗菌肽BMGlvA2重组蛋白的表达。本发明首次将大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌同时作为指示菌，鉴定抗菌肽发酵产物对其均有明显的抑菌活性。本发明还表征了该抗菌肽温度耐受、消化酶耐受、溶血活性等自身性质，也初步提供了其对产气荚膜梭菌的抑制机制。本发明提供的家蚕抗菌肽BMGlvA2有利于在饲料领域进一步开发和应用。

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学领域，特别涉及家蚕抗菌肽BMGlvA2重组蛋白制备方法及其应用

背景技术

随着养殖业的不断发展，抗生素的过度使用导致耐药菌株出现，使得抗生素禁用政策逐步出台。由于抗菌肽具有广泛的来源和较强的抗菌活性，抗菌肽已备受关注成为潜在的抗生素替代品。现已报道的抗菌肽被证实对革兰氏阳性和阴性菌、真菌等均有抑制作用，其中在养殖业中作为饲料添加剂应用最广泛的是昆虫抗菌肽，主要来源于家蚕等，均属于天蚕素家族抗菌肽，其特征具有独特的α-螺旋结构和序列，富含特异性氨基酸。

抗菌肽BMGlvA2来源于家蚕，属于天蚕素家族抗菌肽。其研究的生产方式主要有分离提取，这种高成本的生产严重限制了其工业化生产和应用。此外通过基因工程手段生产该抗菌肽主要也在原核和酵母表达水平，目前丝状真菌里氏木霉已逐渐被引入作为重组蛋白表达的高度优势宿主，它具有强大的表达启动子和优越的糖基化和蛋白加工能力，为工业蛋白生产提供了更有价值的选择。

在养殖业中养猪业是不可缺少的一部分，由于仔猪免疫系统生长不够完善，仔猪腹泻是猪养殖中一种典型的疾病，给其造成巨大经济损失。造成仔猪腹泻的主要原因是细菌性腹泻，病原菌包括肠毒素性大肠杆菌、沙门氏菌和C型产气荚膜梭菌。家蚕抗菌肽BMGlvA2被证明对革兰氏阴性和阳性菌均有一定抑制作用，但对该三种病原菌同时的抑制活性的表征具有显著意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕抗菌肽BMGlvA2重组蛋白，在饲料及其他领域具有更为良好的应用潜力。

具体而言，本发明针对一种基于易错PCR方法获得的家蚕抗菌肽BMGlvA2重组蛋白，通过基因工程技术进行异源表达，进一步挖掘其重组蛋白的抑菌特性和相关机制。养殖行业中造成仔猪腹泻、幼鸡腹泻的致病菌主要有大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌，而目前对该抗菌肽BMGlvA2的抑菌活性研究并未覆盖此三种病原菌。因此该抗菌肽在饲料行业中的应用价值还需进一步挖掘。

为了优化该抗菌肽的重组序列，根据本发明选取的表达宿主，通过易错PCR方法得到了一个该抗菌肽的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过分析其对大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌的抑菌活性，进一步扩充其抑菌范围。本发明不仅得到了抗菌肽BMGlvA2重组蛋白，验证了其对三种致病菌的抑菌活性，还探究了其对产气荚膜梭菌的抑制机制。

本发明的再一目的是提供包含上述抗菌肽的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述抗菌肽的重组菌株，所述重组菌株为里氏木霉Tu6。

本发明还提供所述抗菌肽在饲料或饲料添加剂中的应用。

本发明还提供所述重组菌株在饲料或饲料添加剂中的应用。

本发明还提供所述重组载体在饲料或饲料添加剂中的应用。

根据本发明的技术方案，家蚕抗菌肽BMGlvA2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

SEQ ID NO.1：