[发明专利]DNA提取液以及革兰氏阳性菌DNA的提取方法

说明书

本发明公开了DNA提取液以及革兰氏阳性菌DNA的提取方法。该DNA提取液由溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和溶液Ⅳ组成；其中，溶液Ⅰ的组成包括氯化钠、EDTA和Tris‑HCl，溶液Ⅱ是8％～12.5％质量体积分数的十二烷基硫酸三乙醇胺；溶液Ⅲ是2.5～3.2mol/L氯化钾；溶液Ⅳ是水杨酸甲酯。本发明利用去垢剂十二烷基硫酸三乙醇胺彻底裂解细胞并变性蛋白，从而避免了蛋白酶K的使用，随后通过加入氯化钾溶液，使变性蛋白随着生成的十二烷基硫酸钾一同被沉淀并被离心除去；采用水杨酸甲酯代替酚氯仿异戊醇抽提上清液，不仅彻底去除蛋白杂质，还避免了使用酚时需要进行复杂的水或Tris平衡的步骤，提取上更简单方便。

技术领域

本发明涉及DNA的提取方法，特别涉及DNA提取液以及用于革兰氏阳性菌DNA的提取方法，属于细菌DNA的提取领域。

背景技术

在革兰氏阳性菌菌种鉴定及转化子筛选的过程中，经常要用到基因组DNA用于PCR扩增。传统的酚氯仿法具有通用性广、稳定性高的优点，因此应用较为广泛。然而其操作繁琐、耗时久的缺点使其难以满足大量样本DNA快速提取的要求，同时提取过程中需要使用氯仿、苯酚等有毒有害试剂，对操作人员的健康带来威胁，实验后产生的废弃物垃圾也可能会对环境产生污染。

目前市面上的的细菌基因组DNA提取试剂盒主要利用溶菌酶破碎细胞壁，蛋白酶水解蛋白质，使基因组DNA与蛋白质分离，并通过硅胶膜离心柱收集DNA，使用这种试剂盒提取的DNA浓度高、质量好，且不使用氯仿等有毒有害试剂，但这些试剂盒费用昂贵，含有需要冷藏的组分，且DNA提取仍需1h以上的时间，因此也不适合作为大量微生物样本DNA提取的用途。随后科研人员相继研发出碱裂解法、沸水浴法等快速提取革兰阳性菌基因组DNA的方法，虽然这些方法可以在短时间内提取出基因组DNA，但是提取的DNA含量低且质量差，以其作为PCR反应的模板容易导致PCR扩增的失败。

因此，开发出一种快速、环保、耗费低廉的革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法对于菌种鉴定与革兰氏阳性菌转化子的筛选实验显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种DNA提取液；

本发明的目的之二是提供一种提取革兰氏阳性菌DNA的方法

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了一组DNA提取液，由溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和溶液Ⅳ组成；

其中，溶液Ⅰ的组成成分包括氯化钠、EDTA和Tris-HCl；优选的，各成分的浓度为：氯化钠0.15～0.20mol/L，EDTA 10～20mmol/L，Tris-HCl 10～20mmol/L，其中Tris-HCl的pH值为8.5；优选的，溶液Ⅰ的各组成成分的浓度为：氯化钠0.15mol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 15mmol/L。

溶液Ⅱ是8％～12.5％质量体积分数的十二烷基硫酸三乙醇胺；优选的，溶液Ⅱ是10％质量体积分数的十二烷基硫酸三乙醇胺。

溶液Ⅲ是2.5～3.2mol/L氯化钾；优选的，溶液Ⅲ是3mol/L氯化钾。

溶液Ⅳ是水杨酸甲酯。

本发明进一步提供了一种应用所述DNA提取液提取革兰阳性菌基因组DNA的方法，包括：

(1)用无菌蒸馏水重悬培养物中的革兰氏阳性菌菌体，离心，弃去上清收集菌体；

(2)向溶液Ⅰ中加入溶菌酶后重悬所收集的菌体，静置；

(3)加入溶液Ⅱ颠倒混匀，静置；

(4)加入冰浴的溶液Ⅲ，混匀后离心，取上清加入溶液Ⅳ，震荡混匀至乳状，离心；

(5)取上层水相加入等体积异丙醇沉淀，离心，收集沉淀；