[发明专利]一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种丝氨酸/苏氨酸激酶基因在集胞藻不饱和脂肪酸合成中的应用，构建了集胞藻PCC6803中的spkD基因敲除突变株和spkG基因敲除突变株；本发明首次公开了集胞藻PCC6803中的spkD和spkG基因在改变集胞藻合成不饱和脂肪酸中的重要作用，突变株在正常培养条件下细胞中的C18:2、C18:3n6、C18:3n3、C18:4等脂肪酸的含量明显低于野生型的集胞藻；spkD和spkG两种基因在培养前期与集胞藻多不饱和脂肪酸的产量呈负相关，为下一步通过协同调控spkD和spkG基因表达进而提高蓝藻中亚油酸、α‑亚麻酸和十八碳四烯酸等多不饱和脂肪酸的含量奠定基础。

本申请为申请号202010159165.9、申请日2020年03月09日、发明名称“一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

蓝藻(Cyanobacteria)是一类具有光合自养能力的原核生物。蓝藻细胞能进行自养生长，可以不依赖外界的有机物生存，能利用简单的无机物合成有机物为生命活动提供能量，外源基因表达产生的蛋白质能充分进行折叠、组装，这意味着蓝藻几乎不形成包涵体，并且多数蓝藻及其细胞提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC6803)作为一种单细胞蓝藻，具有结构简单、遗传背景简单、易于培养、便于构建载体、提取物安全、细胞内蛋白酶活性低等特点，是很好的蓝藻基因工程受体。

在外部环境发生变化时，蓝藻依靠包括丝氨酸/苏氨酸激酶系统(serine/threonine kinases system,STKs)在内的两个主要的信号转导系统迅速感知变化，并通过精准调控基因表达，使得相关代谢物发生改变，使蓝藻对外界环境的变化做出积极快速的响应，从而在各种逆境中得以生存下来。

丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)是原核生物所必需的，它参与生长，分裂和分化等活动。STK与其同源磷酸酶一起通过催化可逆蛋白磷酸化来发挥核心作用。在感测到外部刺激后，STK经历自身磷酸化，然后使底物蛋白转磷酸化。特定氨基酸残基的磷酸化可以直接控制靶蛋白的活性或间接通过调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用来发挥作用。

多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指含有两个及以上的双键并且碳原子数目为16-22的直链脂肪酸，主要包括亚油酸(C18:2，LA)、γ-亚麻酸(C18:3n6，GLA)、α-亚麻酸(C18:3n3，ALA)、十八碳四烯酸(C18:4，SDA)、花生四烯酸(C20:4n6，AA)、二十碳五烯酸(C20:5n3，EPA)、二十二碳六烯酸(C22:6n3，DHA)等。根据不饱和键起始于脂肪酸碳链甲基端的位置，利用ω(omega)-编号系统将多不饱和脂肪酸分为多种。具有重要功能的是ω-3类和ω-6类，其中LA、GLA、AA等属于ω-6类多不饱和脂肪酸，ALA、SDA、EPA，DHA等属于ω-3类多不饱和脂肪酸。

PUFAs对人体的健康具有极其重要的作用。亚油酸和亚麻酸是人体必须的多不饱和脂肪酸，它们在人体内不能合成。硬脂酸在工业和化妆品应用中较多。花生四烯酸在人体内不能大量合成。对人体最重要的是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸与其类似物。PUFAs也在动物饲料、能源行业发挥了不可替代的作用。

目前AA等脂肪酸的来源主要是肉类、奶类和鸡蛋。而EPA、DHA的商业来源主要为深海鱼类。但近年来深海鱼类的过度捕捞导致的资源短缺大大限制了PUFAs的生产。从转基因蓝藻中提取PUFAs工艺相对简单，蓝藻相对深海鱼类资源的数量可谓是取之不尽用之不竭，另外没有特殊的异味，胆固醇含量较低。而且随着地球环境日益变化，植物资源受地域及季节限制、环境恶化等影响越来越大，另外海洋鱼类资源日益枯竭及来源于鱼油的PUFAs提纯过程中残留鱼腥味及氧化不稳定性等问题，突出了蓝藻可工厂化养殖不受季节、地域影响，蓝藻资源数量丰富，生产过程无异味等生产不饱和脂肪酸的优点。