[发明专利]一种用于复制性AAV的检测方法

说明书

本发明提供了一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，所述方法不使用辅助病毒，对环境和检测人员安全友好，并且具有极高的检测灵敏度和准确度，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更为具体的，本发明涉及一种对复制型AAV的检测方法。

背景技术

复制型AAV(rcAAV)是指含有wtAAV rep和cap基因的载体。当野生型基因存在时，如果存在辅助病毒，AAV将进行复制。除了具有完全复制能力的AAV之外，还检测到仅含有部分AAV野生型基因组的假重组AAV。rcAAV以及假重组AAV是通过ITR和载体质粒上的相邻序列之间和辅助质粒上的病毒序列之间发生同源重组而产生，wtAAV在很大程度上被认为是非致病性的，但是通过rcAAV或假重组AAV潜在的病毒DNA转移会产生具有解旋酶或DNA剪切酶活性的AAV Rep蛋白的风险，其衣壳蛋白也有可能会触发细胞毒性T淋巴细胞反应。因此，出于安全考虑，在用于临床应用重组AAV生产中，rcAAV的检测十分必要。

目前rcAAV的检测方式大致有两种，其一是在包括腺病毒在内的辅助病毒存在的情况下，感染重组AAV；使用前一轮的细胞裂解液进行多轮感染；使用Southern或qPCR对rep或cap序列进行检测；另一种方式则是不经过放大培养，直接在纯化后的重组AAV产品中进行rep或cap序列PCR检测。

两种检测方式都有它们各自的局限性：直接的qPCR检测虽然可以直接检测出产品中包装的野生型AAV的rep或cap序列，但是这并不等同于野生型AAV的存在，绝大多数被包装的序列都是经错误包装的不完整的质粒序列，因此这种方式存在大量的假阳性情况；如果我们把qPCR序列定位于包装质粒经改造过的ITR-P5位置，虽然可以避免假阳性的情况，但是未经过多轮培养放大的过程，难以达到PCR的检测限。而另一种利用辅助病毒共感染的方式，虽然可以解决直接PCR检测所存在的两个缺点，但是因为检测过程中，一直使用野生型腺病毒或HPV的共感染，而腺病毒或HPV对人的易感性和致病性，对检测人员有着一定的感染风险，相应对培养环境的要求也很高。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，所述方法不使用辅助病毒，对环境和检测人员安全友好，并且具有极高的检测灵敏度和准确度。

本发明的第一个方面，提供一种不依赖于辅助病毒的检测rcAAV的方法，所述方法包括如下步骤，

A.细胞的转染和感染:

第1轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染待测rcAAV，感染2-3天后收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入第2轮待感染细胞；优选的，待检测的rcAAV包含病毒衣壳和包含两端ITR的病毒基因组DNA。

第2-N轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染混合有培养基的上一轮细胞培养基上清，感染2-3天后再次收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入下一轮待感染细胞；

B.用DNase I处理待测步骤A最终获得的细胞培养基上清；

C.利用taqman qPCR技术检测感染的细胞培养基上清中的rcAAV。

优选的，步骤A中所述N＝2-5。

在一种实施方式中，所述细胞为可包装和感染重组AAV病毒的细胞，如293细胞、CHO细胞、HeLa细胞等。

在另一种实施方式中，步骤B包括如下步骤：