[发明专利]一种用于复制性AAV的检测方法

权利要求书

1.一种不依赖于辅助病毒的痕量rcAAV的细胞学检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤，

A.细胞的转染和感染:

第1轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染待测重组AAV病毒，感染2-3天后收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入第2轮待感染细胞；

第2-N轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染混合有培养基的上一轮细胞培养基上清，感染2-3天后再次收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入下一轮待感染细胞；

B.用DNase I处理待测步骤A最终获得的细胞培养基上清；

C.利用taqman qPCR技术检测感染的细胞培养基上清中的rcAAV；

其中，步骤C中taqman qPCR所用的引物和探针序列如下所示：

rcAAV primer SET：

ITR-P5-taqF AGTGGCCAACTCCATCACTA

ITR-P5-taqR CCTCTAATACAGGACCTCCCTAAC

ITR-P5-probe CGTAATTCACGTCACGACTCCACCC

BGH primer SET：

BGH-F CCAGCCATCTGTTGTTTGCC

BGH-R ACTCAGACAATGCGATGCAAT

BGH-Probe CCCGTGCCTTCCTTGACCCT

步骤C中taqman qPCR配置体系为：

。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A中所述N＝2-5。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B包括如下步骤：

在EP管中配置2ⅹDNase I mix，加入无核酶水、2ⅹDNase IBuffer、100U/ml DNase I，吹吸混匀后依次加入待测样品，得到2倍稀释样品1，PCR仪上37℃放置30min；75℃放置15min，处理后样品涡旋混匀，瞬时离心，离心后取稀释样品1加入无核酶水，将其稀释为20倍稀释样品2，涡旋混匀，瞬时离心。