[发明专利]一种提高虫草素发酵产量的方法

说明书

本发明提供了一种提高虫草素发酵产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明是以可产虫草素的酿酒酵母工程菌为生产菌株，优化其发酵条件，在分批发酵对数生长中期添加0.2％‑0.6％(v/v)表面活性剂，改变酵母细胞膜通透性，增加具有细胞毒性的产物虫草素的发酵产量。本发明显著提高了虫草素的发酵产量，缩短了发酵时间，技术方案简单、环境友好、菌种遗传稳定性高。这对于虫草素的工业化生产具有重要的应用意义。

技术领域

本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高虫草素发酵产量的方法。

背景技术

虫草素(Cordycepin)，又称蛹虫草菌素，化学名3′-脱氧腺苷，是第一个从真菌中分离得到的核 苷类抗生素，作为蛹虫草菌的主要活性成分，因其具有抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种生物活性，使 得其在医药和保健食品的开发与应用方面具有巨大的研究价值和广阔的市场前景。

虫草素主要通过化学法和生物法两种途径获得：化学法原料成本高、合成工艺繁琐、产物收率低、 副产物多等劣势限制了其广泛应用；生物法具有原料成本低、工艺条件温和等优点，其中，液体发酵技术 具有空间利用率高、发酵过程容易控制、且产物生成目的性强等优势，逐渐成为虫草素的主要生产方式。 然而，蛹虫草菌发酵周期长，生产强度低，严重限制了虫草素的进一步发展及应用。因此，利用生长周期 短，高生产强度的酵母工程菌来实现虫草素的高效生产，对推动虫草素的生物学功能研究及工业化生产发 展具有重要意义。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为单细胞真核生物，因其具有遗传背景清晰、发酵周期短、 生物安全等优点，被众多研究学者青睐，酿酒酵母作为最常用的模式真菌，已经实现了多种代谢产物的异 源合成，其中包括青蒿酸、香紫苏醇、羽扇豆醇、麦角固醇等。

发明内容

本发明提供了一种提高虫草素发酵产量的方法。

本发明利用酿酒酵母作为底盘细胞，表达虫草素合成关键基因，异源合成虫草素。酿酒酵母在发 酵过程中，目标产物虫草素在胞内不断累积，增大了细胞毒性，同时增加酵母细胞的代谢负担。通过改变 细胞膜的通透性，促进细胞外的营养物质进入细胞内同时细胞内代谢产物分泌到细胞外，弱化细胞的反馈 抑制或反馈阻遏，增加目标产物的碳通量，进而增加目标产物的产量。

为达到上述目的，本发明以能够生产虫草素的酵母工程菌为生产菌株，在含有非离子型表面活性 剂的发酵培养基中发酵。

本发明可采用本领域已知的能够生产虫草素的酵母工程菌为生产菌株，优选以酿酒酵母S288C为 原始菌株构建可产虫草素的酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiaeSHC16(菌种保藏号CCTCC M 2021233)。

作为优选的实施方案，一种提高虫草素发酵产量的方法，具体包括以下步骤：以酿酒酵母S288C 为原始菌株构建可产虫草素的酿酒酵母工程菌SHC16，利用该工程菌分批发酵生产虫草素。通过向培养基 中添加非离子型表面活性剂增加细胞膜通透性的方法提高虫草素发酵产量。

在实施方案中，所述的酵母工程菌构建方法：将基因表达盒P_TDH3-CNS1-T_CYC1-P_TEF1-CNS2-T_ADH1插入带有卡那霉素抗性基因的游离表达载体pYES2-Kan中，将得到的重组质粒导入酿酒酵母S288C得到 基因工程菌。

在实施方案中，以在培养基中添加非离子型表面活性剂为增加酿酒酵母工程菌SHC16细胞膜通 透性的方法。

在实施方案中，所述的非离子型表面活性剂为吐温-60、吐温-80及十二烷基硫酸钠(SDS)。

在实施方案中，所述的非离子型表面活性剂浓度为0.2％-0.6％(v/v)。