[发明专利]牛病毒性腹泻病毒和牛副流感病毒3型的双重检测引物、探针组合

权利要求书

1.牛病毒性腹泻病毒和牛副流感病毒3型的二联检测试剂盒，其包括:

牛病毒性腹泻病毒的RPA检测引物、探针组合，包括：

SEQ ID NO:1所示核酸序列的正向引物；

SEQ ID NO:2所示核酸序列的反向引物；

SEQ ID NO:3所示核酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO:2所示核酸序列的反向引物的5’端修饰Bio；

SEQ ID NO:3所示核酸序列的探针的5’端修饰6-FAM，中部修饰dSpacer，3’端修饰C3Spacer；

牛副流感病毒3型的RPA检测引物、探针组合，包括：

SEQ ID NO:4所示核酸序列的正向引物；

SEQ ID NO:5所示核酸序列的反向引物；

SEQ ID NO:6所示核酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO:5所示核酸序列的反向引物的5’端修饰Dig；

SEQ ID NO:6所示核酸序列的探针的5’端修饰6-FAM，中部修饰dSpacer，3’端修饰C3Spacer。

2.根据权利要求1所述的二联检测试剂盒，其特征在于，还包括：RPA扩增试剂、侧流层析检测试纸条；

所述RPA扩增试剂包括：RehydrationBuffer、ddH₂O、乙酸镁溶液；

所述侧流层析检测试纸条设置C线、T1检测线和T2检测线，其中C线位置包被抗兔二抗，T1检测线位置包被抗-Dig抗体，T2检测线位置包被生物素配体。

3.根据权利要求1或2所述的二联检测试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取试剂和反转录试剂。

4.非诊断目的牛病毒性腹泻病毒和牛副流感病毒3型的二联检测方法，其特征在于，包括：

提取样品RNA后反转录为cDNA；

cDNA与权利要求2所述二联检测试剂盒中的引物、探针混合，经扩增反应获得扩增产物；

所述扩增产物经侧流层析检测试纸条检测，根据条带出现情况判断样品是否含有病毒。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，

所述扩增反应的条件包括：30~40℃反应25min；

所述扩增反应的体系包括：cDNA3μL、上下游引物各2.1μL、探针各0.6μL、RehydrationBuffer 29.5μL、ddH₂O 5.4μL。

6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括对阳性对照品和阴性对照品检测；

所述阳性对照品为含有目的片段的质粒；

所述阴性对照品为水、PBS缓冲液或不含有病毒的细胞培养液；

所述根据条带出现情况判断样品是否含有病毒包括：

检测阴性对照样品扩增产物的侧流试纸条只在C的位置上出现条带，且检测阳性对照样品的扩增产物的侧流试纸条在C线、T1检测线和T2检测线的位置上都出现条带，表明试验成立，否则实验失效；

检测待测样品扩增产物的侧流试纸条的条带在C线和T1检测线的位置上出现两个条带，表明待测样品中含有牛副流感病毒3型；

检测待测样品扩增产物的侧流试纸条的条带在C线和T2检测线的位置上出现两个条带，表明待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；

检测待测样品扩增产物的侧流试纸条的C线、T1检测线和T2检测线的位置上都出现条带，表明待检动物中既含有牛病毒性腹泻病毒又含有牛副流感病毒3型病毒；

检测待测样品扩增产物的侧流试纸条仅在C线位置上出现一个条带，表明待检样品为阴性，既不含有牛副流感病毒3型，也不含有牛病毒性腹泻病毒。