[发明专利]一种高效高特异性检测HPA基因型的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、多组HPA引物组与检测模板退火；

步骤2、在DNA聚合酶的作用实现模板退火延伸；

步骤3、延伸产物结合荧光基团显色或荧光探针在DNA聚合酶外切酶活性下释放报告基团；

步骤4、通过熔解曲线或不同荧光探针标记实现对不同的HPA基因型进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述步骤4中的检测为：通过引物的筛选性和扩增产物的特异性两种方式耦合实现对不同模板的检测，检测方法包括HPA高效高特异性引物组、报告反应体系及高效反应液。

3.根据权利要求2所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述扩增产物的特异性由两种方式，一种由特异性引物延伸扩增野生型模版，诱导特异性的探针报告基团水解形成成野生型的荧光信号，而突变型由所特异性的扩增，诱导产生突变型的荧光，实现两种不同模板的识别。另一种方式根据引物设计调整不同扩增产物大小，实现不同产物的Tm值不同，通过荧光信号在Tm条件下顺速也模板解离，荧光信号迅速衰减，因而通过不同Tm方式实现对不同模板的区分。

4.根据权利要求3所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述HPA高效高特异性引物组由通用引物与错配碱基组成，所述通用引物为与HPA模板碱基互补配对的碱基组成，所述的错配碱基的错配方式为：强错配，中等错配，弱错配；碱基组合方式为：CC、GG，中等错配为：AC、GT,弱等错配为：AA、TT。

5.根据权利要求4所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述通用引物由15～35个碱基组成；所述的通用引物的TM为55～80℃。

6.根据权利要求5所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述的错配碱基位置为3’端倒数第1～8位；优先地倒数第1～3位；所述的错配碱基包括但不限于正向引物、反向引物、或者正反向引物，所述的引物3‘端根据检测模板分型的不同采用不同的碱基与其对应的分型匹配。

7.根据权利要求6所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述报告反应体系用于指示检测基因的分型；所述的报告反应体系包含但不限于SYBGREEN荧光染料、探针法；所述的报告反应体系通过荧光信号的差异、退火温度的差异中的一种或多种实现。

8.根据权利要求7所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述高效反应液包括但不限于盐反应液、保护剂及核酸聚合酶的一种或多种；盐反应液由KCl、Tris-HCl、NH4Cl中的一种或多种组成；保护剂由土温-20、BSA中的一种或多种组成，所述的核酸聚合酶包含DNA聚合酶、RNA逆转录酶中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，KCl的浓度为25～1000mMol/L，Tris-HCl的浓度为10～500mMol/L，NH4Cl的浓度为0.5～50mMol/L，土温-20的浓度为：0.05～10％浓度；BSA的浓度为：0.1～20％浓度，DNA聚合酶包含：Ttaq DNA聚合酶、Platinum II Taq热启动DNA聚合酶、Glod360 DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、Ulltra PF DNA聚合酶、Super Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶；Pfu DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶。