[发明专利]一种外泌体的纯化方法

说明书

本发明提供一种外泌体的纯化方法，包括：(1)将富含外泌体的细胞培养液离心；(2)将步骤(1)得到的上清液和40％(w/v)碘帕醇溶液一起离心，得到外泌体粗提液；步骤(1)得到的上清液和碘帕醇的体积比为500～600:1；(3)将外泌体粗提液用缓冲溶液稀释4～6倍和外泌纯一起离心，外泌纯位于所述外泌体粗提液下部；外泌体粗提液和外泌纯的体积比为2:1～1.5；所述外泌纯为25～30％(w/v)的碘帕醇溶液；(4)分别收集步骤(3)离心分层后的产物。本发明的纯化方法通过对一定浓度的碘帕醇经过超速离心可以很快速的形成连续密度梯度，且能够用于较高纯度外泌体的分离，有利于提高获得的外泌体的纯度。

技术领域

本发明涉及外泌体制备领域，具体涉及一种外泌体的纯化方法。

背景技术

用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞或细胞内不同组分分层达到分离的目的。常用的密度梯度介质主要为蔗糖和氯化铯。外泌体是通过内体内陷形成多囊泡体后通过质膜融合向细胞外释放而形成的纳米级脂质囊泡，大小在30～150nm，密度范围通常为1.12至1.17g/mL，比DNA、RNA和大多数蛋白质轻。传统的差异超速离心是外泌体分离和纯化最常用的方法之一，但当外泌体离心到离心管底部时由于离心力的作用往往不能保证外泌体的完整性且分离纯度有限。在一些研究中，已经使用了在超速离心管中添加缓冲垫(Optiprep或Exojuice)或密度梯度介质(蔗糖或氯化铯)，来提高外泌体的纯度或保证其完整性。使用蔗糖密度梯度和氯化铯密度梯度离心达到密度梯度平衡费时且较难去除，蔗糖溶液和氯化铯溶液容易形成高的渗透压不利于外泌体完整性的维持。因此对于开发一种新的密度梯度介质，并处于安全考虑容易去除，对于高纯度外泌体的获取将是很有必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种外泌体的纯化方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种外泌体的纯化方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将富含外泌体的细胞培养液于9000～11000g离心；

(2)将步骤(1)得到的上清液和碘帕醇溶液一起离心，得到外泌体粗提液，离心时，碘帕醇位于所述步骤(1)得到的上清液下部，离心力为100000～110000g；所述碘帕醇溶液的浓度为40～42％(w/v)；步骤(1)得到的上清液和碘帕醇的体积比为500～600:1；

(3)将外泌体粗提液用缓冲溶液稀释4～6倍和外泌纯一起离心，外泌纯位于所述外泌体粗提液下部，离心力为100000～110000g；外泌体粗提液和外泌纯的体积比为2:1～1.2；所述外泌纯为25～30％(w/v)的碘帕醇溶液；

(4)分别收集步骤(3)离心分层后的产物。

上述方法通过对一定浓度的碘帕醇经过超速离心可以很快速的形成连续密度梯度，且能够用于较高纯度外泌体的分离，有利于提高获得的外泌体的纯度。

优选地，所述步骤(3)中，缓冲溶液为PBS缓冲液。

优选地，所述步骤(1)中，离心的时间为25～35min。

优选地，所述步骤(2)中，离心的时间为65～75min。

优选地，所述步骤(3)中，离心的时间为65～75min。

本发明还一种用于外泌体的纯化方法的连续密度梯度介质，所述连续密度梯度介质的制备方法包括以下步骤：将外泌纯在100000g离心力下离心70min。

上述连续密度梯度介质由上层到底层，密度逐渐连续提高，可以用于较高纯度外泌体的分离，能够提高获得的外泌体的纯度。