[发明专利]一种免疫磁微粒的偶联方法、稀释液和应用

说明书

本发明提供一种免疫磁微粒的偶联方法、稀释液和应用。本发明的抗体‑磁珠偶联工艺采用先在酸性pH条件下对羧基磁珠进行活化，然后在接近中性条件下使活化后的羧基磁珠与抗体进行偶联，温和的反应条件保持了抗体的生物活性，也减少羧基磁珠活化后的聚集，提高了羧基磁珠偶联抗体的效率。本发明提供的封闭液使磁珠上未偶联上抗体的羧基位点被BSA、氨基酸或/和小分子肽和PEG以离子键或共价键结合，同时使偶联在羧基磁珠上的抗体保持正确和稳定的形态，提高检测性能，增强灵敏度。本发明提供的免疫磁微粒稀释液，可使制备的免疫磁微粒，如CA125抗体‑羧基磁珠，经该稀释液稀释后在4℃放置12个月或在37℃放置7天后仍能保持良好的分散性和稳定性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种免疫磁微粒的偶联方法、分散液和应用。

背景技术

磁微粒在化学发光免疫分析中应用广泛，其常见的表面活性基团有羧基和氨基等，在一定条件下，通过中间体活化，可与抗体或抗原上的氨基或羧基偶联，用于抗原或抗体的检测。常见羧基磁珠偶联抗体的方式有一步法和两步法：一步法是将磁珠和抗体混合后，再加入交联剂进行反应。一步法对抗体的要求较高，需耐受较高浓度的交联剂，但如果交联剂量过低往往影响偶联效率，所以一般很少采用这种交联方式。

两步法是将磁珠活化后，再加入抗体进行偶联。羧基磁珠通常选择在酸性pH(pH4.0～6.5)的MES缓冲液对磁珠进行活化，然后在相同的条件下加入一定量的抗体进行偶联反应，如申请号为CN105319356A的专利申请和专利号CN103926398B的发明专利都是采用在相同的酸性条件下进行活化和偶联反应，但在低pH条件下偶联的抗体-磁珠通常容易发生聚集。羧基磁珠也有选择在中性至碱性pH(pH7.0～8.0)的磷酸盐缓冲液中进行第二步偶联反应，如专利号为CN105478087B的发明专利和申请号为CN108503710A的发明专利申请就是采用该偶联方式，但在高pH的磷酸盐条件下，偶联效率往往很低。另外，还有选择两步均在pH7.0的磷酸缓冲液中进行偶联，如发明专利CN102305858B中所公开的偶联方法，但高pH条件加上磷酸盐的共同作用，通常会导致EDC活化效率降低，难以获得预期的偶联效果。

通过上述现有方法很难获得偶联效率很高的免疫磁微粒，或者即使获得了偶联效率较高的免疫磁微粒，但这些微粒往往分散性差，放置时间越久越易发生聚集，并且在显微镜下可见明显的团状聚集物，导致用该免疫磁微粒制备的化学发光试剂精密度、灵敏度和稳定性差，极大地影响了试剂性能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种免疫磁微粒的偶联方法、分散液和应用，解决现有技术中免疫磁微粒偶联效率低、分散性差以及使用该免疫磁微粒制备的化学发光试性能差等问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种免疫磁微粒的偶联方法，包括以下步骤：

(1)活化：在缓冲体系a中利用交联剂对洁净的磁珠进行活化，得活化后的磁珠；

(2)偶联：在缓冲体系b中向活化后的磁珠中加入抗体，混匀、孵育，得到抗体-磁珠偶联物；

(3)封闭：在所述步骤(2)得到的抗体-磁珠偶联物中加入封闭液进行封闭，得到抗体-磁珠偶联的免疫磁微粒终产物；

所述缓冲体系a的pH值为4～6，所述缓冲体系b的pH值为6.5～7.3。抗体-磁珠偶联工艺采用改良的两步法，先在酸性pH条件下对羧基磁珠进行活化，然后在接近中性条件下中使活化后的羧基磁珠与抗体进行偶联，并通过优选的封闭液进行封闭，温和的反应条件不仅保持了抗体的生物活性，也有效减少羧基磁珠活化后的聚集，有效提高羧基磁珠偶联抗体的偶联效率，相比现有的偶联工艺，背景值更低，灵敏度更高，磁珠分散性和稳定性更好，提升了试剂性能。

在所述步骤(1)中，所述交联剂的浓度为10～100mg/ml，所述交联剂和所述磁珠的质量比为1∶100～100∶1，所述活化时间为10～60min。