[发明专利]一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗及制备方法

说明书

本发明提供了一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗及制备方法，使用毕赤酵母GS115菌种进行外源基因表达，混合制备三价重组酵母亚单位疫苗，可预防鸡柔嫩艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫和毒害艾美尔球虫三种同属不同种球虫的三价重组酵母亚单位疫苗，实现了3‑1E、NA4和IMP1三种基因在毕赤酵母表达系统中的高效表达，具有较好的免疫保护效果，可用于柔嫩艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫和毒害艾美尔球虫等三种球虫混合感染的免疫预防。

技术领域

本发明提供了一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗，其特征在于使用毕赤酵母GS115菌种进行外源基因表达，混合制备三价重组酵母亚单位疫苗，可预防鸡柔嫩艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫和毒害艾美尔球虫三种同属不同种球虫的三价重组酵母亚单位疫苗，同时还提供了其制备方法，用于鸡球虫病的预防，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡球虫病是由鸡球虫引发的一种寄生虫病，严重威胁着禽类的健康，该病呈全球分布，危害较大致死率高。目前已知的鸡球虫共9种，国际公认有致病力的为7种，国内常见危害较大的为柔嫩艾美尔球虫（E. tenella）、巨型艾美尔球虫（E. maxima）、毒害艾美尔球虫（E. necatrix）等。此前球虫病的传统防治手段以药物和活卵囊疫苗为主，随着时间的推移，鸡球虫耐药虫株的产生和药物残留问题等增加了防治鸡球虫病的难度，活卵囊疫苗在使用过程中存在引入外来虫种，球虫“返祖”等情况，存在安全隐患。相较之下，基因工程疫苗可以弥补这些弊端。但目前基因工程疫苗还处于研发阶段，并没有注册商品化的基因工程疫苗，因此研制出安全高效的基因工程疫苗从而投入生产是预防鸡球虫病的手段之一。鸡球虫病流行病学调查显示球虫感染大多为混合感染，因此在防治球虫病疫苗的研制中需要针对多种球虫混合感染进行防治。目前已报道了一些球虫免疫保护性抗原基因并进行了原核表达，但尚无3-1E、NA4和IMP1基因在毕赤酵母表达系统中进行外源基因表达的报道，也无鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗及制备方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现:

根据E. tenella保护性抗原基因3-1E、E. maxima保护性抗原基因IMP1和E. necatrix保护性抗原基因NA4基因序列，利用Oligo7.0软件设计引物，PCR扩增目的片段并回收，将目的基因与表达载体pPICZαA连接。构建的重组质粒进行双酶切鉴定，鉴定后测序，测序正确的重组质粒进行诱导表达，利用SDS-PAGE和Western-blot进行分析鉴定，大量表达及纯化后分别与4%氢氧化铝胶佐剂按照1：4混合均匀制备成单价重组酵母疫苗，再将三种单价疫苗等比例混合制备成鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗。

本发明所述的鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗制备方法，步骤如下：

1、鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗的制备