[发明专利]一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗及制备方法

权利要求书

1.一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗，其特征在于使用毕赤酵母GS115菌种进行外源基因表达，混合制备疫苗，可预防鸡柔嫩艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫和毒害艾美尔球虫三种同属不同种球虫的三价重组酵母亚单位疫苗。

2.如权利要求1所述的一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗的制备方法，步骤如下：

根据E. tenella保护性抗原基因3-1E、E. maxima保护性抗原基因IMP1和E. necatrix保护性抗原基因NA4基因序列，利用Oligo7.0软件设计引物如下表：

3-1E：上游引物 GAATTCATGGGTGAAGAGGCTGATACT；

下游引物 GCGGCCGCGAAGCCGCCCTGGTACA；

NA4：上游引物 GAATTCATGGCTCGTCTCTCTTTTGTTTCTC；

下游引物 GCGGCCGCGAAGAGAGCGAAAGCGGAGATAA；

IMP1：上游引物 GAATTCATGGGGGCCGCTTG；

下游引物 GCGGCCGCATCTTGCGACACTTTAGTGGGCTC；

PCR扩增目的片段并回收，将目的基因与表达载体pPICZαA连接；构建的重组质粒进行双酶切鉴定，鉴定后测序，测序正确的重组质粒进行诱导表达，利用SDS-PAGE和Western-blot进行分析鉴定，大量表达及纯化后分别与4%氢氧化铝胶佐剂按照1：4混合均匀制备成单价重组酵母疫苗，再将三种单价疫苗等比例混合制备成鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗。

3.如权利要求2所述的一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗的制备方法，步骤如下：

提取E. tenella、E. maxima和E. necatrix总RNA，并反转录为cDNA，通过PCR法扩增3-1E、NA4和IMP1基因，目的片段大小为553bp、774bp和1131bp；

将PCR产物与表达载体pPICZαA在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，转化至感受态细胞DH5α中，挑取阳性克隆进行双酶切鉴定，鉴定成功后进行测序；

构建重组表达载体pPICZαA-3-1E、pPICZαA-NA4和pPICZαA-IMP1，将重组载体质粒线性化，电转染至酵母细胞GS115中进行诱导表达，并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定，蛋白纯化后产物分别与4%氢氧化铝胶佐剂按1：4混合，制备成单价重组酵母亚单位疫苗，分别命名为GS115-E.tenella3-1E、GS115-E.necatrix NA4和GS115-E.maximaIMP1，同时将重组蛋白GS115-pPICZαA-3-1E、GS115-pPICZαA-NA4和GS115-pPICZαA-IMP1等比例混合，与4%氢氧化铝胶佐剂按1：4混合制成三价混合疫苗GS115-E-N-I。