[发明专利]一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法

说明书

本发明提供了一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法，包括如下步骤：步骤一，依次配制标准品储备液、标准品工作溶液和内标溶液；步骤二，样品处理；步骤三，LC‑MS/MS分析。本发明首次进行了毛发中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己的分析方法的开发验证。本发明的方法简便快速，一步提取，毛发用量少，仅需10mg，采用提取溶液在低温下湿磨提取毛发中的目标物，研磨时间为10min，色谱运行时间短(8min)，灵敏度满足日常检案要求。

技术领域

本发明涉及钩吻生物碱检测技术领域，尤其涉及一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法。

背景技术

钩吻(Gelsemium elegans)，民间俗称很多，常见的有胡蔓草、断肠草、烂肠草、大炮茶等，为马前科胡蔓藤属野生常绿缠绕藤本植物胡蔓藤(Gelsemium elegang Benth)的全草，主要分布在东南亚和我国南部的贵州、广东、福建、云南和广西等省。全草有剧毒，其毒性主要来源于吲哚类或氧化吲哚类生物碱。其中有毒成分主要有钩吻素子(Koumine)、钩吻素甲(Gelsemine)、钩吻素己(Gelsenicine)等，钩吻素子是最丰富的钩吻生物碱，其次为钩吻素甲，而钩吻素己是毒性最高的钩吻生物碱。钩吻和其他良性草药之间常常会因其形态相似而混淆，从而导致误食和中毒，因此，血液、尿液和毛发等生物检材中钩吻素己、钩吻素子和钩吻素甲的检测是判断钩吻中毒或相关案事件认定的关键。

钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的浓度在血液样品中鲜有报道，而在其他生物检材如尿液或毛发中则几乎没有报道。在一些中毒案件中，许多中毒者经过多天抢救后死亡，未能及时留取血液、尿液等，此时毛发分析可提供有价值的证据。毛发分析已广泛用于法医和临床毒理学。与传统的生物检材(例如血液和尿液)相比，毛发具有检出时限长、能反映较长时间(几个月)的药物使用情况等优点，且样品易获取、易保存，据我们所知，尚未有关于分析测定毛发中钩吻生物碱的研究报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

提供一种同时测定毛发中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，依次配制标准品储备液、标准品工作溶液和内标溶液；

步骤二，将空白毛发样品和待测毛发样品分别依次用超纯水、丙酮清洗，收集最后一次丙酮清洗液吹干，吹干后再分别用甲醇复溶用以排除外污染因素，毛发样品室温下干燥；将干燥后的所述待测毛发样品剪成小段，精密称后置于研磨管中，加入研磨珠、所述内标溶液和甲醇，使用冷冻研磨仪磨碎；然后离心，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测样品溶液；

将干燥后的所述空白毛发样品剪成小段，精密称后分别置于若干研磨管中，分别加入所述标准品工作溶液适量得到不同质量浓度的系列空白毛发样品，加入研磨珠，使用冷冻研磨仪磨碎；然后离心，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到系列空白毛发样品溶液；

步骤三，将所述待测样品溶液和系列空白毛发样品溶液分别进样，LC-MS/MS分析，

其中，色谱条件为：RestekAllure PFP丙基柱，100mm×2.1mm，5μm；流动相A为含0.1％甲酸的20mmol/L乙酸铵缓冲溶液，流动相B为甲醇；流速为0.3～0.5mL/min，流动相A：B＝30～40：60～70等度恒流洗脱8～12min，柱温为室温；自动进样器保持在4℃；

质谱条件为：电喷雾离子器质谱的正离子模式检测，多离子模式监测，采用Analyst software 1.5(Waters)和MultiQuant 3.0.2工作站进行数据收集和分析；质谱仪离子喷雾电压为5500V，离子源温度550℃，气帘气为30psi，雾化气(GS1)、辅助气(GS2)为50psi。