[发明专利]一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，涉及一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用；步骤为：首先基于嗜盐古菌(Haloterrigena sp.)KZCA68‑1的基因组获得编码基因nirKsubgt;Htg/subgt;；通过分子克隆技术将nirKsubgt;Htg/subgt;连接到载体上构建重组质粒；将重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞在Hv‑YPC液体培养基中培养至稳定期后低温离心收集菌体，于细胞裂解液中进行重悬，经超声破碎、离心收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化以及凝胶过滤层析纯化后，获得高纯度还原酶，记为NirKsubgt;Htg/subgt;。本发明得到的NirKsubgt;Htg/subgt;具有良好的酶学特性，高盐腌制食品、废水处理等过程中降解亚硝酸盐。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用。

背景技术

亚硝酸盐作为一种食品添加剂在食品中广泛应用，尤其是各类高盐食品。过量的亚硝酸盐摄入会导致慢性致癌和急性中毒，将亚硝酸盐控制在安全限量内是目前国内外的研究热点。利用亚硝酸盐还原酶降解亚硝酸盐具有高效、健康等特点，是目前最常用的方法。目前亚硝酸盐还原酶大多来源于乳酸菌，对盐的耐受性不强，限制了在高盐食品工业中的应用。

嗜盐古菌是一类依赖于高盐环境的极端微生物，是耐盐亚硝酸盐还原酶的良好微生物来源。目前关于嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的研究非常有限，主要受限于纯酶的制备步骤繁琐且得率低。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一个新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因及嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法。

本发明基于一株嗜盐古菌Haloterrigena sp.KZCA68-1的基因组获得一条新型的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因命名为nirK_Htg，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；基于nirK_Htg编码的新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶命名为NirK_Htg。

为了实现以上目的，本发明包括以下步骤：

(1)构建pTA04-nirk_Htg重组表达质粒：

首先基于嗜盐古菌Haloterrigena sp.KZCA68-1的基因组获得一条新型的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因nirK_Htg，进一步设计含有酶切位点EcoRI和BamHI的目的片段引物，利用常规PCR技术扩增目的片段nirK_Htg；通过分子克隆技术将nirK_Htg连接到pTA04载体上构建重组质粒；

(2)转化嗜盐古菌Haloferax volcanii：

将步骤(1)成功构建的重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述宿主为菌株Haloferax volcanii；

将转化后的重组宿主细胞接种于Hv-YPC液体培养基中进行活化培养，培养后得到培养液；再取培养液接种至Hv-YPC液体培养基中摇瓶培养至稳定期，进一步离心收集菌体，低温保存备用；

(3)重组亚硝酸盐还原酶的纯化：

收集步骤(2)保存的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，即粗酶液，将粗酶液用于重组蛋白纯化；首先采用镍柱亲和层析纯化获得含有咪唑的目的蛋白；最后利用凝胶过滤层析去除咪唑，获得高纯度的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，记为NirK_Htg。

优选的，步骤(1)中所述嗜盐古菌(Haloterrigena sp.)KZCA68-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为CGMCC 22195，保藏日期：2021年4月16日。