[发明专利]一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建pTA04-nirk_Htg重组表达质粒：

首先基于嗜盐古菌(Haloterrigena sp.)KZCA68-1的基因组获得一条嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因nirK_Htg，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；进一步设计含有酶切位点EcoRI和BamHI的目的片段引物，利用常规PCR技术扩增目的片段nirK_Htg；通过分子克隆技术将nirK_Htg连接到pTA04载体上构建重组质粒；

所述嗜盐古菌(Haloterrigena sp.)KZCA68-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC 22195；

(2)转化嗜盐古菌(Haloferax volcanii)：

将步骤(1)成功构建的重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述宿主为菌株Haloferax volcanii；

将转化后的重组宿主细胞接种于Hv-YPC液体培养基中进行活化培养，培养后得到培养液；再取培养液接种至Hv-YPC液体培养基中摇瓶培养至稳定期，进一步离心收集菌体，低温保存备用；

(3)重组亚硝酸盐还原酶的纯化

收集步骤(2)保存的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，即粗酶液，将粗酶液用于重组蛋白纯化；首先采用镍柱亲和层析纯化获得含有咪唑的目的蛋白；最后利用凝胶过滤层析去除咪唑，获得高纯度的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，记为NirK_Htg。

2.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述嗜盐古菌(Haloferax volcanii)购自日本微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为：JCM 8879。

3.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述Hv-YPC培养基成分为：酵母提取物5.0g，大豆蛋白胨1.0g，酸水解酪素1.0g，KCl4.2g，MgSO₄·7H₂O 33.0g，MgCl₂·6H₂O 30.0g，NaCl 144.0g，1M Tris-HCl(pH 8.0)12.0mL，CaCl₂ 0.33g，上述组分用蒸馏水定容于至1L，调节pH至7.5，115℃灭菌30min。

4.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述活化培养的条件为：37℃，180rpm培养3～4天；所述的低温保存的温度为-20℃。

5.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的镍柱亲和层析纯化的具体操作为：首先20倍柱床体积的Lysis buffer用于平衡镍柱；将离心后的上清液上样；然后使用缓冲液I洗脱杂蛋白；缓冲液II洗脱目的蛋白，最后获得含有咪唑的目的蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，所述缓冲液I成分为2M NaCl，20mM Tris-HCl，40mM咪唑，pH 8.0；所述缓冲液II成分为2M NaCl，20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH 8.0；所述Lysis buffer成分为2M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8.0。

7.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述凝胶过滤层析为利用pure蛋白分离纯化系统，HiTrap^TM Desalting层析柱去除咪唑，以Lysis buffer为流动相，通过凝胶过滤层析获得高纯度的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，即为NirK_Htg。